PCR başarısı, deneysel tasarımınıza bağlı olarak değişebilir.
Küçük hatalar genellikle düşük verim veya yanlış negatif/pozitif ürünlerle sonuçlanabilir.
PCR reaksiyonunuzun başarısını sağlamak için 4 temel ipucu:
1. Primer Tasarımı
• En uygun primer konsantrasyonunu bulun.
• İkincil yapı oluşumunu önlemek için 18-30 nükleotid uzunluğunda bir primer ve %40-60 GC içeriği önerilir.
• Primer homolojisini kontrol edin. Primerleriniz arasında veya dahili olarak herhangi bir bağlanma, PCR verimliliğinin düşmesine neden olacaktır.
• Primerlerin bağlanma dereceleri 2 (A+T)+4 (G+C) formülü ile hesaplanır.
• Bir G veya C ile bitirin. Primer dizinizin 3′ ucunu bir G veya C ile kapatmak, uzatma bölgesinde primer uzamasını güçlendirecektir.
2. Hedef Dizi
• Bir PCR reaksiyonu, DNA şablonunuzun hem kalitesinden hem de miktarından etkilenebilir.
• Kaliteli bir DNA dizisi, reaksiyonun özgülüğünü ve ürün verimini arttıracaktır.
• Kontaminasyonu önlemek için dikkatli olun! Protein ya da kimyasal kontaminasyon, spesifik olmayan bağlanmalara neden olabilir veya PCR’ı tamamen inhibe edebilir.
• DNA absorbansınızın 260nm/280nm oranının ≥1.8 olduğunu kontrol edin.
3. Reaksiyon Reaktifleri
• Tehlikeli reaktifler PCR reaksiyonunuzun verimliliğini etkiler. Birçok laboratuvarda hazır ticari bileşenler kullanılsa da bilinmesi gereken ve dikkate alınması gereken bileşenler:
DNA Polymerase, dNTP, magnezyum konsantrasyonu.
4. Termal Profil
• Thermocycler protokolleri ve koşulları, PCR için oldukça standardize edilmiştir. İşte dikkate alınması gereken üç ana husus:
» Modifiye edilmiş PCR koşulları:
» Bağlanma Sıcaklığı: primer diziliminizin erime sıcaklığından 3 °C’de altında ayarlamanızı en uygunu olacaktır. Daha ileriki optimizasyon için anneling sıcaklığı 1-2 °C’lik adımlarla arttırılabilir.
» Uzatma süresi: Her 1 kb amplikon için 1 dakikalık uzatma süresi ayarlamanız önerilir. Optimal uzama oranları, DNA polimerazın işlenebilirliğine bağlı olabilir.
