Skip to content

PCR

1970’lerin başına kadar incelenmesi en zor molekül DNA iken; 1985 yılında Kary Mullis tarafından keşfedilen Polimeraz Zincir Reaksiyonu sayesinde bugün durum tamamen değişerek tespiti en kolay makro molekül durumuna geçmiştir.

PCR (Polymerase Chain Reaction- Polimeraz Zincir Reaksiyonu) genetik materyaldeki hedeflenen bölgeyi enzimatik olarak çoğaltmak için uygulanan basit invitro DNA sentezi yöntemidir. PCR, DNA replikasyonunu taklit ederek çalışan moleküler tanımlama tekniğidir. Genetik materyalin çoğaltılmasından sonra tespit edilmesini temel alır. Çok az sayıda var olan genetik materyali dahi tespit edebilmesi sayesinde en hassas ve doğruluğu en yüksek olan teknik kabul edilmektedir.

PCR teknikleri ile; genetiği değiştirilmiş DNA’ların varlığının tespiti sayesinde gıda içeriklerindeki değişikliğin kontrolü, insan/hayvan/bitki enfeksiyonların teşhisi, özel DNA parçalarının klonlaması, bakteri, virüs, mantar veya parazit kontaminasyonlarının identifikasyonu, genetik hastalıkların teşhisi, DNA parmak analizleri, gen düzenlemeleri gibi gen mühendislikleri çalışmaları yapılabilmektedir. Biyoloji, gıda, klinik araştırma, ziraat hatta arkeoloji dahil birçok ana bilim dalında uygulama alanına sahiptir.
Teknik çift zincirli genetik materyalin yüksek ısıya maruz bırakılarak tek zincir hale gelmesine ve sonrasında sentetik oligonukleotidlerin hedeflenen materyale bağlanarak zincirin uzayarak tekrar bağlanması ile belirli sayıda tekrarlanması esasına dayanır. 30-50 föngü arasında tekrar edilerek PCr ürünlerinin elde edilmesi sağlanır. Bir PCR döngüsü 3 aşamadan oluşur:

  • 1.Denatürasyon (Denaturation): Kalıp DNA’nın 94-98 ⁰C sıcaklıkta belli sürelerde bekletilerek çift sarmal yapısının birbirlerinden ayrılmasıdır.
  • 2. Bağlanma/Hibridizasyon (Anneling): Tek zincirli açılan DNa zincirinin çoğaltılması ve hedef dizinin her iki ucuna spesifik primerlerin bağlanmasıdır. 52-65 ⁰C sıcaklık ve 15-60 sn arasında gerçekleşen döngüdür.
  • 3. Uzama (Extention): DNA zincirine bağlanan primerlerin yeni bir DNA oluşturacak şekilde uzamasıdır. DNA polimeraz enziminin etkisi ile zincir uzaması sağlanır. Tek zincirli hedef DNA komplementeri olan primer ve Taq polimeraz yardımı ile master miks içindeki dNTP’leri kullanarak zincirin uzamasını sağlar. Sıcaklığın 72 ⁰C’ye kadar arttırılması aktiviteyi arttırır.

Bir PCR döngüsü için 5 ana malzeme vardır:

  1. Kalıp DNA:
  2. Sentetik oligonükleotidler
  3. dNTP
  4. Magnezyum klorür (MgCl2)
  5. Taq Polimeraz

Bir PCR döngüsü için 5 temel bileşen gereklidir:

  • Hedef DNA: Amplifiye edilmek istenen DNA örneğidir. Başarılı bir DNA amplifikasyon için saf bir şekilde izole edilmiş DNA’ya ihtiyaç vardır. Moleküler biyolojik yöntemlerin uygulanabilmesi için PCR öncesinde kullanılacak olan genetik materyalin PCR inhibitörlerini içermediğinden emin olunmalıdır.
  • Oligonükleotid Primer: Çoğaltılmak istenilen genetik materyalin 5’ ve 3’ uçlarına bağlanmayı sağlayan tamamlayıcı görevi gören sentetik malzemelerdir. Yüksek sıcaklıklarda kullanılabilmesi için 16-20 baz büyüklüğünde olmaları önerilir. Yüksek konstantrasyonlarda kullanılan primer derişimleri yanlış bağlanmalara neden olabileceği gibi düşük konsantrasyonlarda kullanılan primerler ise PCR verimini düşürebilmektedir. Bundan dolayı döngü sayısına optimumu derişimin seçilmesi gerekmektedir.
  • dNTP (deoksiribonükleotid: dATP, dGTP, dTTP, dCTP): DNA molekülünün çoğalabilmsi için gerekli olan yapıtaşıdır. Primerler ile başlatılarn çift zincir oluşumu Taq polimeraz yardımı ile dNTP’lerin kullanılmasıyla uzatılmaya başlanır.
  • Magnezyum Klorür (MgCl2): Uygun pH ve iyon koşullarını sağlamak üzere tampon karışımı olarak kullanılır.
  • Taq polimeraz: DNA moleküllerinin eşleniği ile birleşerek polimerizasyonunu gerçekleştiren enzimdir. Termostabil bir yapıda olduğundan yüksek sıcaklıklarda dahi işlevini sürdürür. Yüksek sıcaklıklarda analizin stabil kalmasını sağladığı için mutlaka bulunması gereken bir malzemedir.

Günümüzde klasik PCR özellikle kontaminasyon riski ve uzun zaman alması dolayısıyla yerini gerçek-zamanlı PCR cihazlarına bırakmıştır.