Eksozomlar, hücrelerden tüm vücuda salınan ve hücreler arası iletişimi sağlayan küçük hücredışı veziküllerdir. Salındıkları hücreye özgü çeşitli yapılar taşırlar. Bunlara örnek olarak spesifik microRNAs, proteinler ve metabolitler verilebilir.

Eksozomlar vücut içerisinde çeşitli sıvılar yardımıyla dolaşabilirler. Bu sıvılara örnek olarak kan, tükürük, anne sütü, amniyotik sıvı, beyin omuriliği sıvısı ve idrar gösterilebilir.

Eksozom araştırmalarında bu sıvılar kullanılabilir, eksozom izolasyonu ile tam olarak işlevleri ortaya çıkarılabilir.

Peki eksozomlar hangi hücreye neler taşıyacağını nereden biliyor?

Tam olarakhedef hücre- eksozom ilişkisi bilinmesede araştırmacılar eksozomların yüzeyinde bulunan özel protein belirteçleri sayesinde bu ilişkinin sağlandığını düşünmekteler.

Vücut sıvılarından veya kültür ortamından eksozomları arındırmak için evrensel bir yöntem yoktur. Ultrasantrifüjleme bir zamanlar geleneksel yöntem iken, şimdi çeşitli alternatif yöntemler mevcuttur.

Eksozomlar farklı yöntemlerle saflaştırılabilir

Ultrasantrifügasyon: aşırı yüksek hızda örnekleri spin edebilen santrifüj ile eksozomları ortamdaki diğer maddelerden ayrıştırır.

Polimer Presipitasyon: polimerleri kullanarak (PEG gibi) solüsyodan eksozomları ayrıştırır.

Boyut Dışlama Kromatografisi: numuneler, bilinen bir gözenek boyutuna sahip sabit bir faz içeren bir kolondan geçirilir.

İmmünoafinite: eksozomun yüzeyindeki spesifik proteinleri bağlamak için antijenleri kullanır

Ultrafiltrasyon: numune, bilinen bir moleküler ağırlık değerine sahip bir filtreden geçirilir

Silicon Carbide: Spesifik pH koşulları altında eksozomları bağlayan Norgen’in patentli reçine yöntemine dayanır

Norgen çeşitli numune türlerinden hızlı ve kolay bir eksozom saflaştırma yöntemi sağlar.

Spesifik tampon koşulları altında, eksozomlar, Silicon Carbide reçinesine bağlanır ve böylece yüksek derecede saflık ve özgüllükle elde edilmiş olunurlar.

Eksozomlar purifiye edildikten sonra ne içerdiklerini ve ne işlevi sağladıklarını anlayabilmemiz için çeşitli analiz yöntemlerine ihtiyaç vardır. Bunlardan bazıları:

Analiz

Transmisyon Elektron Mikroskobu (TEM)

Eksozom morfolojisini görselleştirmek için

RNA İzolasyon ve Yeni Nesil Sekanslama

Eksozom içinde bulunan RNA türlerini belirlemek için

Mass Spectrometry

Eksozomlar üzerindeki ve içindeki proteinleri tanımlama ve karakterize etmek için kullanılabilir.

Downstream Uygulamalar

Kozmetik Alanında

Eksozomlar, topikal yara iyileşmesinde, potansiyel cilt ve saç gençleştirmeye etkisine kadar dermatolojik ve kozmetik endüstrilerinde araştırmalarda kullanılmaktadır.

İlaç Taşıma

Rksozomların vücutta doğal oluşumu, hücre özgüllüğü ve biyolojik engelleri geçme yeteneği nedeniyle, eksozomlar yeni bir ilaç dağıtım sistemi olarak umut vaat etmektedir.

Hastalık Takibi

Eksozomların taşıdıkları maddeleri analiz ederek, hastalık gelişimini, ilerlemesini ve tedavi etkisini izlemeye yardımcı olacak biyobelirteçler oluşturulabilir.

Plazmid izolasyonunda iyi verim almak hayati önem taşır. İyi bir plazmid verimi elde etmek için ön hazırlığınızı nasıl optimize edersiniz ve düşük verime ne neden olur? Bu soruları ve çok daha fazlasını aşağıda ele alıyoruz:

Plazmid izolasyonu esnasında en iyi verim nedir?

Üç ana plazmid hazırlığı türü vardır: mini, midi ve maksi. Plazmid DNA miktarı protokoller ve kitler arasında değişiklik gösterir, ancak aşağıdaki tablo bu üç farklı hazırlama yöntemi için ortalama bir aralık sağlar.

Prep Tipi	Plazmid DNA Geri Kazanımı (µg)
Mini Prep	5­50
Midi Prep	50-200
Maxi Prep	200-1000

**Her iki numune aynı anda ve aynı şekilde işlendiğinde, bir numune iyi verim verirken diğer plazmid düşük verim verirse sorun ne olabilir? Sorusuna, pek çok şey plazmid hazırlıkları arasında verim farklılıklarına neden olabilir. Bu gizemi madde madde çözelim ve neler yapabileceğimizi gözden geçirelim.

1. Sorunlu Insertler

Aynı protokolü kullanarak aynı anda iki plazmid hazırladınız ve farklı verimler elde ettiniz. Plazmidler aynı ‘’omurgaya’’ sahipse o zaman sebep, bir insert olabilir. Bazı insertler bakteri için sorunlu olabilir; örneğin bakterileri hasta eden bir protein veya tekrarlayan diziler gibi kararsız olabilir. Sorunun üstesinden gelmek için özel hücre hatları kullanmayı deneyebilirsiniz.

2. Kopya Sayısı

İkinci önemli nokta, insert boyutunun plazmidin kopya sayısını nasıl değiştirdiğidir. Büyük insertler, plazmidin kopya sayısını azaltacaktır, yani iyi bir verim elde etmek için daha fazla hücre büyütmeniz gerekecektir.

Genler farklı vektörlere klonlanırsa, sorun plazmidlerin farklı hızlarda kopyalanması olabilir. Biri yüksek kopyalı bir plazmid olabilir, diğeri orta ve hatta düşük kopyalı bir plazmid olabilir.

3. Kültür Doygunluğu

Kültürü hazırlarken her zaman iyi sonuç alınır. Eski kolonilerden aşılama veya kültürün çok doygun hale gelmesi plazmid verimini ciddi şekilde negatif olarak etkileyecektir. Kültürlerin geç gecikme evresinde olmasını ve aşırı doygun olmasını istemeyiz.

4. Eski Kolonilerin Kullanılması

Başlangıç kültürleri oluşturulurken kullanılan petrinin yaşı önemlidir. Petriniz eskiyse güzel ve büyük bir koloni seçmiş olsanız bile hepsi canlı hücreler olmayacaktır. Bu nedenle en iyi sonucu elde etmek için başlamadan önce yeni bir petride saflaştırın.

5. Antibiyotik Sorunları

Zayıf plazmidin bir diğer nedeni de antibiyotiklerdir. Bakteriler kültürde büyürken antibiyotiği parçalarlar. Yeterli antibiyotik eklenmediğinde veya stoklar eski ve güçleri yeterli değilse antibiyotik çok baskın olamayabilir bunun sonucunda antibiyotik içermeyen bir kültüre sahip olabilirsiniz.

6. Lizis ve Nötralizasyon Problemleri

Lizis içeriğindeki bazı reaktifler çoğunlukla iyi ve stabildir. Ama havaya maruz kaldıklarında zamanla bozulabilirler ve ilk günkü kadar iyi çalışmayabilirler.

Çalışanların plazmid izolasyonunda yaptıkları en büyük hatalarından biri ise parçalama işlemleridir. Protokoller normalde nazik olmanızı söylese de fazla hassas olmak çok da iyi bir durum değildir.

Diğer bir yaygın sorun, lizisin çok uzun süre devam etmesine izin verilmesi ve bunun kalıcı olarak denatüre, olmuş sindirilemez DNA ile sonuçlanmasıdır.

7. İzopropanol Kalitesi

Birçok laboratuvarda, yıl boyunca açılıp kapatılan büyük şişelerde izopropanol bulunur. Çöktürme basamağından iyi verim elde etmek istiyorsak kullanılan izopropanolün eski olmadığından emin olmalısınız.

8. Peleti Kaybetmek

İzopropanol peletleri camsı ve berraktır, görülmesi zordur. Bunla ilgili en iyi uygulama sabit açılı bir rotorda santrifüjlemeden sonra peletin oluşmasını beklediğiniz noktayı işaretlemek olabilir. Böylece izopropanolü döktüğünüzde plazmidi nerede bulacağınızı bilirsiniz.

Sabit açılı bir rotor kullanırken peletinizin nerede olduğunu bilmenizi sağlamanın bir başka yolu da tüplerinizi hep aynı şekilde yüklemektir, bu durumda peletiniz her zaman aynı yerde olacaktır.

!! Pek çok ticari kit üreticisinin bu sorun için geliştirdiği ‘’çökelticiler’’ veya silika disk filtreleri kullanılan kitler ürettiğini belirtmek isteriz.

!! Yine küçük bir not; santrifüjleme süresini ve hızını optimize edilenden kısa tutmamanızı öneriyoruz. Santrifüjleme hızını arttıramıyorsanız süresini asla kısaltmayınız.

9. Kolonların Tıkanması

Kolonların tıkanmasından endişe ediyorsanız kolon basamağına geçmeden önce Whatman kağıdından süzün.

10. Kolonlarda Kalan DNA

Elüsyondan sonra DNA kolonlarda kalabilir. Kalan DNA’yı süzmek için ayrı bir elüsyon daha gerçekleştirin. 50°C civarında ısıtılmış elüsyon tamponu kullanmak da elüsyon verimini artırmaya yardımcı olabilir.

Referanslar:

Maniatis, T., Fritsch, E. F. and Sambrook, J. Molecular cloning. New York: Cold Spring Harbor Laboratory; 1982. pp 545. 

Begbie S. et al. (2005) The Effects of Sub-Inhibitory Levels of Chloramphenicol on pBR322 Plasmid Copy Number in Escherichia coli DH5?.  Journal of Experimental Microbiology and Immunology (JEMI). 7:82-8.