Etiket Arşivleri: PCR

Her PCR reaksiyonunun sorunu aynıdır:

Hedef DNA’nın çok az amplifikasyonuna rağmen hedef dışı DNA’ların daha fazla amplifikasyona uğraması. Ancak bazı ek reaktifler kullanarak PCR reaksiyonlarınızın sorununu çözebilirsiniz. Hangi PCR reaktifinin ne işe yaradığını ve sizin için en iyi koşulu belirleyebilmek sizin elinizdedir.

PCR ek reaktifleri genellikle aşağıdaki iki yoldan biri ile çalışır:

① İkincil yapıları azaltıp hedef DNA’nın amplifikasyonunu arttırarak ↑

② Spesifik olmayan bağlanmaları azaltıp hedef dışı DNA’ların amplifikasyonunu azaltarak ↓

Polimeraz aktivitesi için Mg⁺² gereklidir. Yeterli Mg⁺² olmadığında taq polimeraz inaktifhalde kalır. Doğru Mg⁺² konsantrasyonu özgünlüğü arttırır. Düşük Mg⁺² konsantrasyonu spesifik olmayan bağlanmaları arttırır.

Sığır serum albümin, çeşitli moleküler biyoloji uygulamalarında, özellikle de restriksiyon enzim sindirimleri ve PCR’de yaygın olarak kullanılan bir ilavedir. PCR’de BSA, fenolik bileşikler gibi kirleticilerle mücadelede yardımcı olabilir. Ayrıca reaksiyon bileşenlerinin tüp duvarlarına yapışmasını önlediği de bildirilmektedir.

GC açısından zengin ve zor DNA hedeflerinde amplifikasyonu geliştirir. Amplifiye edilmesi zor olduğu bilinen dizilerde kullanımı idealdir. DNA Tm sıcaklığını düşürülmesini sağlar.

Triton X-100, Tween 20, NP-40 gibi kimyasal bileşenlerin kullanımı da ikincil yapıları azalttığı düşünülmektedir. Bu reaktiflerin kullanımı PCR verimini arttırabilir fakat spesifik olmayan amplifikasyonları da arttırabilir. Bundan dolayı dikkatli kullanılmalıdır.

İkincil DNA yapılarını azalttığı düşünülür. Bundan dolayı GC içeriği zengin yapıların PCR analizi yapılırken eklenmesi önerilebilir. Ancak DMSO, Taq polimeraz aktivitesinin düşmesine de neden olabileceğinden aralarındaki dengenin kurulması son derece önemlidir.

Organik bir PCR ek reaktifidir. Spesifik olmayan bağlanmayı azaltarak kirli PCR reaksiyonlarını temizlemek için çalışır.

Tüm bu bileşenler PCR sonuçlarını iyileştirse de analiziniz için en iyisinin ne olduğunu ilk aşamada tahmin etmek mümkün değildir. Bir PCR reaksiyonunu optimize edebilmek için çok fazla deneme yapmak gerekir.

PCR başarısı, deneysel tasarımınıza bağlı olarak değişebilir.
Küçük hatalar genellikle düşük verim veya yanlış negatif/pozitif ürünlerle sonuçlanabilir.

PCR reaksiyonunuzun başarısını sağlamak için 4 temel ipucu:

1. Primer Tasarımı

• En uygun primer konsantrasyonunu bulun.
• İkincil yapı oluşumunu önlemek için 18-30 nükleotid uzunluğunda bir primer ve %40-60 GC içeriği önerilir.
• Primer homolojisini kontrol edin. Primerleriniz arasında veya dahili olarak herhangi bir bağlanma, PCR verimliliğinin düşmesine neden olacaktır.
• Primerlerin bağlanma dereceleri 2 (A+T)+4 (G+C) formülü ile hesaplanır.
• Bir G veya C ile bitirin. Primer dizinizin 3′ ucunu bir G veya C ile kapatmak, uzatma bölgesinde primer uzamasını güçlendirecektir.

2. Hedef Dizi

• Bir PCR reaksiyonu, DNA şablonunuzun hem kalitesinden hem de miktarından etkilenebilir.
• Kaliteli bir DNA dizisi, reaksiyonun özgülüğünü ve ürün verimini arttıracaktır.
• Kontaminasyonu önlemek için dikkatli olun! Protein ya da kimyasal kontaminasyon, spesifik olmayan bağlanmalara neden olabilir veya PCR’ı tamamen inhibe edebilir.
• DNA absorbansınızın 260nm/280nm oranının ≥1.8 olduğunu kontrol edin.

3. Reaksiyon Reaktifleri

• Tehlikeli reaktifler PCR reaksiyonunuzun verimliliğini etkiler. Birçok laboratuvarda hazır ticari bileşenler kullanılsa da bilinmesi gereken ve dikkate alınması gereken bileşenler:
DNA Polymerase, dNTP, magnezyum konsantrasyonu.

4. Termal Profil

• Thermocycler protokolleri ve koşulları, PCR için oldukça standardize edilmiştir. İşte dikkate alınması gereken üç ana husus:
» Modifiye edilmiş PCR koşulları:
» Bağlanma Sıcaklığı: primer diziliminizin erime sıcaklığından 3 °C’de altında ayarlamanızı en uygunu olacaktır. Daha ileriki optimizasyon için anneling sıcaklığı 1-2 °C’lik adımlarla arttırılabilir.
» Uzatma süresi: Her 1 kb amplikon için 1 dakikalık uzatma süresi ayarlamanız önerilir. Optimal uzama oranları, DNA polimerazın işlenebilirliğine bağlı olabilir.