Letgen Biyoteknolojinin önemli partnerlerinden birisi olan Microsynth, özellikle nükleik asit sentezi ve analizi alanında Avrupa’nın önde gelen şirketlerinden biridir.
Kantitatif PCR (qPCR) gerçekleştiriyorsanız, ct değerinin ne olduğunu bilmeniz ve anlamanız çok önemlidir. Bu ayki bültende ct değerinin qPCR’deki kritik rolünü, değişen isimlendirmelerini, nasıl hesaplandığını ve işler bazen ters gittiğinde neler olduğunu anlatacağız.
Tüm İsimlendirmeleri
Bir ct değeri yıllar içinde teknoloji geliştikçe ve değiştikçe aşağıda listelediklerimiz de dahil olmak üzere birçok isim verildiğini vurgulamak isteriz. Türkçeye çevrildiğinde anlamları biraz garipleşse de bu değerlerin hepsi aynıdır. qPCR terminolojisini standardize etmek amacıyla MIQE (Kantitatif Gerçek Zamanlı PCR Deneylerinin Yayınlanması için Asgari Bilgi kılavuzları) Cq değerinin kullanılmasını önerir.
Ct – (threshold cycle) eşik döngüsü
Cp – (crossing point) geçiş noktası
TOP – (take-off point) kalkış noktası
Cq – (quantification cycle) niceleme döngüsü
Nedir bu Cq Değeri?
Gerçek zamanlı PCR (qPCR) bir hedef dizinin mutlak miktarını ölçmek veya numuneler arasında bir hedef dizinin nispi miktarlarını karşılaştırmak için kullanılır. Bu teknik, hedef diziye bağlanan özel bir floresan sinyalinin amplifikasyonu ile gerçek zamanlı olarak izlenir. Floresan probları sekansa özgü olmasına rağmen çoğu qPCR deneyi esnasında arka plan floresanları da meydana gelebilir. Hedef sekans ile ilgili anlamlı bilgiler toplamak istiyorsak bu arka plan sinyallerini göz ardı etmek veya hesaba katabilmek çok önemlidir. Bu sorun qPCR’daki iki faktör ile ele alınır: Eşik çizgisi ve Cq değeri.
Eşik çizgisi; hedef sekansın tespit seviyesindeki bir floresan yoğunluğuna ulaştığı noktadır. Otomatik ya da manuel olarak hesaplanabilen, istatistiksel olarak anlamlı bir artışı yansıtan sinyaldir.
Cq değeri; numunenin reaksiyon eğrisinin eşik çizgisiyle kesiştiği PCR döngü sayısıdır. qPCR cihazının yazılımı, numunenin her biri için Cq değerini hesaplar ve çizelgeler. Cq başlangıç DNA kopya sayısını hesaplamak için kullanılır, çünkü Cq değeri hedefin başlangıç miktarı ile ters orantılıdır. Her döngü sonunda qPCR cihazınız floresan verilerini toplayacaktır ve ilk PCR döngüsünden yaklaşık 15 PCR döngüsüne kadar düz bir çizgi olarak gördüğünüz floresan sinyali, 15. döngüden sonra eşik çizgisinin üzerine çıkarak logaritmik olarak amplifikasyon göstermeye başlayacaktır.
Şekil. Gerçek zamanlı bir PCR amplifikasyon eğrisindeki eşik seviyesi ve Cqdeğeri.
Cq değerini etkileyen Faktörler
Bu değeri etkileyebilecek birçok faktör vardır.
• Floresans emisyonu, bir çözeltideki pH ve tuz konsantrasyonundan etkilenebilir. Bu nedenle yüksek kaliteli, son kullanım tarihleri geçmemiş ve uygun koşullarda saklanmış PCR bileşenleri kullandığınızdan emin olmalısınız.
• ROX gibi pasif referans boyalar kullanıyorsanız ROX’un FAM boyasına olan olan oranı reaksiyon değerlerini belirleyecektir. Düşük ROX miktarı yüksek reaksiyon değeri üretir.
• PCR verimliliği; primerlerin özgüllüğüne, primer Tm sıcaklığına ve numunenin başlangıç konsantrasyonu ve saflığına bağlıdır. %90’ın üzerinde çıkan bir verimlilik PCR etkinliği için kabul edilebilirdir. Mükemmel bir PCR’ı 10 katlık dilüsyonlar arasındaki cq farkının yaklaşık 3,3 döngüye denk gelmesiyle tespit edebiliriz.
• Yine korelasyon katsayısının (R²) 1 olması PCR çalışmasının mükemmel olduğunu gösterir.
• Standart eğri çalışması yapılırken en az 4 noktayı 3 tekrarlı çalışmak en sağlıklı sonuçları almanızı sağlayacaktır.
• RNA/cDNA çalışmalarında alanın RNAse kontaminasyonunu engellemek için sürekli steril tutmanız ve numuneleri dondur çöz yapmaktan kaçının.
Referanslar
1. Bustin SA, et al. The MIQE guidelines: minimum information for publication of quantitative real-time PCR experiments. Clin Chem. 2009. 55(4):611-22. doi: 10.1373/clinchem.2008.112797.
2. C. Schrader, et al. PCR inhibitors – occurrence, properties and removal. J AppliedMicrobiology. 113(5):1014-26. doi: 10.1111/j.1365-2672.2012.05384.x
Plazmidlerin ne olduğundan ve uygulama alanlarından daha önceki bültenlerimizde bahsetmiştik. Plazmid kopya sayılarına daha yakından bakarken laboratuvarda işimize yarayacak yolları inceleyelim.
Bu ayki bültenimizin içeriği;
- Plazmid kopya sayısı tam olarak ne anlama geliyor?
- Plazmid kopya sayısı neden önemlidir?
- Plazmid kopya sayısı nasıl değiştirilebilir üzerine olacak.
Plazmid kopya sayısının verim üzerinde büyük bir etkisi olabilir ve bazen yüksek bir plazmid DNA kopya sayısına sahip olmak en iyisi iken bazı zamanlarda dezavantaj da olabilir.
Plazmid Kopya Sayısı Nedir?
Plazmid kopya sayısı, konak bakteri hücresinde bulunan tek bir plazmidin molekül sayısını belirtir. Düşük (hücre başına 15-20 kopya), orta (hücre başına 20-100 kopya) ya da yüksek (hücre başına 500-700 kopya) kopya sayısı olarak ifade edilirler ve üç ana faktöre bağlı olarak büyüklük bakımından farklılık gösterir.
1) Ori ve bileşenleri (örneğin, ColE1 RNA I ve RNA II).
2) Plazmidin boyutu ve bununla ilişkili eklenti (daha büyük ekler ve plazmidler, hücre için muazzam bir metabolik yükü temsil ettikleri için daha düşük bir sayıda çoğaltılabilir).
3) Kültür koşulları (konakçı üzerindeki metabolik yükü etkileyen faktörler).
Plazmidinizin Kopya Sayısını Bilmek Neden Önemli?
Çalışmaya başlamadan önce plazmidinizin hangi kategoriye girdiğini bilmek çok önemlidir. Düşük kopya sayılı bir plazmidle çalıştığınızı biliyorsanız, düşük çıkan verime çok şaşırmamalısınız ve daha fazla kültür ortamı oluşturmaya karar verebilirsiniz.
Yüksek bir plazmid kopya sayısının bir avantajı, plazmidin daha yüksek stabilitesidir. Ama bunun tam tersi de olmaz diyemeyiz!
Yüksek Plazmid Kopya Sayısı Ne Zaman Önemlidir?
• Protein üretim çalışmaları yaparken düşük protein verimi yaşıyorsanız yüksek kopyalı bir plazmid sayısının muhtemelen metabolik yükünün yüksek olması nedeniyle protein toplanması ve yetersiz bir modifikasyona yol açabilir.
• Klonlama çalışmalarında yüksek plazmid kopya sayısı kullanmak daha yüksek verimle sonuçlanacaktır.
Düşük Plazmid Kopya Sayısı Ne Zaman İyidir?
• Yüksek kopya sayısı her zaman iyi gibi düşünülse de bazı durumlar düşük kopya sayısına daha uygundur. Mesela, bir mantar proteini üzerinde antibakteriyel özellikleri hakkında çalışmak istiyorsunuz; burada toksik etkileri en aza indirmek ve bakterileri öldürmemek için düşük plazmid kopya sayısı ile çalışmak iyi olabilir.
• Aşırı ifade edilen proteinler, yanlış protein-protein eşleşmeleri proteinin kendisinde yapısal sorunlara yol açabilir.
Plazmid Kopya Sayısını Nasıl Değişikliğe Uğratırız?
Yukarıda saydığımız nedenlerden dolayı, çalışmalarınızı yaparken aralarından seçim yapabileceğiniz farklı kopya sayılarına sahip, farklı plazmidlere sahip olmak avantajlı olabilir. Plazmid replikasyonu hakkında yapılan detaylı çalışmalar plazmid kopya sayısını nasıl değiştirmemiz gerektiğinin önünü açmıştır:
• Konak bakteriyi yüksek sıcaklıklarda büyüterek bazı plazmidlerin kopya sayısını arttırabilirsiniz.
• Konak bakterinin kloramfenikole maruz kalması bakteriyel protein sentezini inhibe eder, bu da kromozomal replikasyon inhibisyonuna ve hücre bölünmesi inhibisyonuna yol açar. Plazmidler uzun ömürlü proteinlere ihtiyaç duyarlar replikasyon ve hücre bölünmesi durmuş olsa bile replike olmaya devam ederler. Sonunda ortamda proteinler tükendiğinde plazmid replikasyonu da duracaktır ancak ortalama kopya sayısı önemli ölçüde artmış olacaktır.
qPCR, kalitatif ve kantitatif bir tespit aracı olarak oldukça popülerdir. Çoğunlukla güvenilir, tekrarlanabilir veriler elde edebilmek için bir standart eğri kullanmanız gerekir. qPCRstandart eğrisinin neden ve nasıllarını birlikte inceleyelim:
qPCR ilk bakışta çok basit bir teknik gibi görünür ve optimize edildiğinde deneyinizde harika sonuçlar verir. Çalışılan örnekte gerçekten neler olduğunu yansıtan tutarlı ve doğru sonuçlar elde ettiğimizden emin olmak için en doğru kontrolleri kullanmalıyız. Bu temel kontrollerden bir tanesi standart eğri grafiği oluşturmaktır. Standart eğri grafiği primerlerimizin verimliliği ve DNA kalitesini kontrol edebilmemizi sağlar.
Mükemmel qPCR Verileri için Verimli Primerler Önemlidir:
Bilgisayar başında bir biyoinformatik yazılımı yardımı ile primer tasarlaması yaptınız, NCBI portalı aracılığı ile spesifik olduğunu gözlerinizle gördünüz, emin bir şekilde tasarladığınız primerlerin sentezlenmesi için siparişlerini verdiniz, primerleriniz elinize ulaştıktan sonra bunu bir qPCR deneyi ile test etmek hata yapmamak, yanlış sonuçlar almamak ve zaman kaybetmemek için bir zorunluluktur.! Bu hiçbir araştırmacının istemeyeceği büyük bir risktir. Çalışmayı hemen yapmak için sabırsız olmayın ve ilk çalışmanız için mutlaka bir deney deseni oluşturun!
Elde edilen ct değerlerinin doğru olduğundan ve gerçeği yansıttığından emin olmak önemlidir. Tek bir dilüsyon ile yaptığınız çalışmalarda aldığınız ve iyi göründüğünü düşündüğünüz logaritmik eğriler her zaman doğru sonuç vermeyebilir ve verimli bir şekilde çoğaldığının garantisini vermezler. Bu nedenle primerlerinizi her zaman bir standart eğri ile test etmelisiniz. Bir standart eğri grafiği primerlerin ilgili hedefe verimli ve hassas bağlandığını ve uzamayı doğru yaptığını gösterebilir ki bu da kritik bir noktadır.
Bir qPCR Standart Eğrisi Nasıl Gerçekleştirilir?
Bir standart eğri grafiği oluşturmak için aynı DNA örneğinin 10 kat dilüe edilmiş en az 5 farklı veri noktasının miktarlarını kullanırız. Teorik olarak bakıldığında doğru tasarlanmış verimli primerler doğru orantılı olarak doz-yanıt eğrisi şeklinde sonuçlanacaktır. Sonrasında elde ettiğimiz Ct değerlerini y eksenine ve mL başına olan log DNA kopyalarını da x eksenine çizmeniz gerekir. Bunun için çok basit bir Excel dokümanı hazırlayabilirsiniz. Aşağıda bir standart eğri örneği verilmektedir.
İkinci önemli konu, tekrarlanabilirliği de değerlendirebilmemiz için en az 3 kopya halinde çalışmak kesin sonuç elde etmek adına çok daha doğru olacaktır. Son bir dipnot ise her reaksiyonda saflıklarından emin olduğunuz DNA’yı pipetaj yapmak ve kontaminasyon problemini de ortadan kaldırmak için negatif kontrol kullanmayı unutmayın.
Standart Eğrinizi Analiz Etme
Bazı qPCR yazılımlarında standart eğriyi analiz etmek için uygulamalar bulunsa da birçok cihazda bu seçenek mevcut değildir. Eğrinizi analiz ederken hesaplamak ve değerlendirirken dikkat etmeniz gereken birkaç madde vardır:
PCR Verimliliği
DNA molekülünün her döngüde ikiye katladığını düşünürsek PR verimlilik aralığı %90 ile %110 arasında olmalıdır. Neden bu değer aralığını veriyoruz? Çünkü reaksiyonlar hiçbir zaman mükemmel değildir. Seyreltmeler nedeni ile bazı hatalar yapıldıysa verimlilik %100’ün üzerine çıkacaktır. %90’ın altındaki değerler için, inhibitör kontaminasyonuna veya düşük primer verimine sahip olduğunuz yorumunu yapabiliriz.
R² Değeri
R² değeri, korelasyon katsayısıdır ve korelasyon içinde iyi bir güven sağlamak için > 0,99 olmalıdır.
Bu değer, her örneğin değerleri arasında iyi bir doğrusal ilişki olup olmadığını görmenizi sağlar. Düşük bir değer, zayıf bir seri seyreltmeyi gösterebilir. Bunu önlemek için, seri dilüsyonlarınızı yaparken iyi kalibre edilmiş pipetler kullanarak doğru şekilde pipetleme yaptığınızdan ve dilüsyonları iyice karıştırdığınızdan emin olun.
Cq Değerleri için Standart Sapma
Amplifikasyonu gerçekleştirmek, hataları azaltmaya yardımcı olur ve R² ve PCR verimlilik değerlerinizi daha güvenilir hale getirir. Ancak, tekrarlarınızda çok fazla değişkenlik varsa, bunların güvenilir değerler olduğundan söz edemeyiz.
Kopyalarınızın ne kadar güvenilir olduğunu kontrol etmek için standart sapmayı (SD) hesaplayın. İyi kopyalar 0,2 SD birim içinde olmalıdır. Değillerse, standart eğrinizi yeniden yapmanız gerekebilir.
qPCR standart eğrinizden güzel veriler alırsanız, primerlerin verimliliğinden memnun kalma yolundasınız demektir! Ancak standart eğri verileriniz çok iyi değilse ne olur? İşte size iki seçenek:
Ya Primerleriniz Verimli değilse?
qPCR standart eğri grafiğinin orantısız sonuçlanması şaşırtıcı bir şekilde sıklıkla olur; her DNA konsantrasyonu yaklaşık olarak aynı Ct değeriyle sonuçlanır. Bu, primerlerin hedefe verimli bir şekilde bağlanmadığı anlamına gelir.
Kötü Bir qPCR Standart Eğrisi Düşük DNA İfadesini Yansıtabilir
Kötü bir standart eğri, primerlerden kaynaklanmıyor olabilir. Numunenizde hedefiniz kötü ifade ediliyorsa standart eğriniz yanlış olabilir. Bu hedefin çalışmakta olduğunuz hücre tipinde ifade edilip edilmediğini doğrulamanız gerekir. Hedefiniz yetersiz ifade ediliyorsa, amplifikasyon için kullanılan DNA miktarını artırın. Ya da tam tersi… Bu, sonraki deneylerinizde kullanacağınız uygun DNA miktarını belirlemenize yardımcı olabilir. 1 ng’de iyi bir amplifikasyon elde etmek varken neden reaksiyon başına 10 ng kullanıyorsunuz? Bu şekilde çok değerli olan DNA örneklerinizi farklı qPCR çalışmalarınızda kullanabilirsiniz.
qPCR standart eğri adımını atlamak çoğu zaman cazip gelebilir ama primer verimliliği ve DNA kalitesini değerlendirebilmek için bu adım uzun vadede iyi sonuçlar doğurabilir.
Primerlerinizin verimli olmasını sağlamak için başlangıçta zaman ayırmak, uzun sürede çok zaman kazandırabilir ve nihayetinde daha iyi sonuçlara yol açabilir!
Referanslar
1. Korenkova V, et al. (2015) Pre-amplification in the context of high-throughput qPCRgene expression experiment. BMC Mol Biol. 16:5.
2. Van Peer G, Mestdagh P, Vandesompele J. (2012) Accurate RT-qPCR gene expressionanalysis on cell culture lysates. Sci Rep. 2:222.
Eksozomlar, hücrelerden tüm vücuda salınan ve hücreler arası iletişimi sağlayan küçük hücredışı veziküllerdir. Salındıkları hücreye özgü çeşitli yapılar taşırlar. Bunlara örnek olarak spesifik microRNAs, proteinler ve metabolitler verilebilir.
Eksozomlar vücut içerisinde çeşitli sıvılar yardımıyla dolaşabilirler. Bu sıvılara örnek olarak kan, tükürük, anne sütü, amniyotik sıvı, beyin omuriliği sıvısı ve idrar gösterilebilir.
Eksozom araştırmalarında bu sıvılar kullanılabilir, eksozom izolasyonu ile tam olarak işlevleri ortaya çıkarılabilir.
Peki eksozomlar hangi hücreye neler taşıyacağını nereden biliyor?
Tam olarakhedef hücre- eksozom ilişkisi bilinmesede araştırmacılar eksozomların yüzeyinde bulunan özel protein belirteçleri sayesinde bu ilişkinin sağlandığını düşünmekteler.
Vücut sıvılarından veya kültür ortamından eksozomları arındırmak için evrensel bir yöntem yoktur. Ultrasantrifüjleme bir zamanlar geleneksel yöntem iken, şimdi çeşitli alternatif yöntemler mevcuttur.
Eksozomlar farklı yöntemlerle saflaştırılabilir:
Ultrasantrifügasyon: aşırı yüksek hızda örnekleri spin edebilen santrifüj ile eksozomlarıortamdaki diğer maddelerden ayrıştırır.
Polimer Presipitasyon: polimerleri kullanarak (PEG gibi) solüsyodan eksozomları ayrıştırır.
Boyut Dışlama Kromatografisi: numuneler, bilinen bir gözenek boyutuna sahip sabit bir faz içeren bir kolondan geçirilir.
İmmünoafinite: eksozomun yüzeyindeki spesifik proteinleri bağlamak için antijenleri kullanır
Ultrafiltrasyon: numune, bilinen bir moleküler ağırlık değerine sahip bir filtreden geçirilir
Silicon Carbide: Spesifik pH koşulları altında eksozomları bağlayan Norgen’in patentli reçine yöntemine dayanır
Norgen çeşitli numune türlerinden hızlı ve kolay bir eksozom saflaştırma yöntemi sağlar.
Spesifik tampon koşulları altında, eksozomlar, Silicon Carbide reçinesine bağlanır ve böylece yüksek derecede saflık ve özgüllükle elde edilmiş olunurlar.
Eksozomlar purifiye edildikten sonra ne içerdiklerini ve ne işlevi sağladıklarını anlayabilmemiz için çeşitli analiz yöntemlerine ihtiyaç vardır. Bunlardan bazıları:
Analiz
Transmisyon Elektron Mikroskobu (TEM)
Eksozom morfolojisini görselleştirmek için
RNA İzolasyon ve Yeni Nesil Sekanslama
Eksozom içinde bulunan RNA türlerini belirlemek için
Mass Spectrometry
Eksozomlar üzerindeki ve içindeki proteinleri tanımlama ve karakterize etmek için kullanılabilir.
Downstream Uygulamalar
Kozmetik Alanında
Eksozomlar, topikal yara iyileşmesinde, potansiyel cilt ve saç gençleştirmeye etkisine kadar dermatolojik ve kozmetik endüstrilerinde araştırmalarda kullanılmaktadır.
İlaç Taşıma
Rksozomların vücutta doğal oluşumu, hücre özgüllüğü ve biyolojik engelleri geçme yeteneği nedeniyle, eksozomlar yeni bir ilaç dağıtım sistemi olarak umut vaat etmektedir.
Hastalık Takibi
Eksozomların taşıdıkları maddeleri analiz ederek, hastalık gelişimini, ilerlemesini ve tedavi etkisini izlemeye yardımcı olacak biyobelirteçler oluşturulabilir.
Plazmid izolasyonunda iyi verim almak hayati önem taşır. İyi bir plazmid verimi elde etmek için ön hazırlığınızı nasıl optimize edersiniz ve düşük verime ne neden olur? Bu soruları ve çok daha fazlasını aşağıda ele alıyoruz:
Plazmid izolasyonu esnasında en iyi verim nedir?
Üç ana plazmid hazırlığı türü vardır: mini, midi ve maksi. Plazmid DNA miktarı protokoller ve kitler arasında değişiklik gösterir, ancak aşağıdaki tablo bu üç farklı hazırlama yöntemi için ortalama bir aralık sağlar.
Prep Tipi | Plazmid DNA Geri Kazanımı (µg) |
Mini Prep | 550 |
Midi Prep | 50-200 |
Maxi Prep | 200-1000 |
**Her iki numune aynı anda ve aynı şekilde işlendiğinde, bir numune iyi verim verirken diğer plazmid düşük verim verirse sorun ne olabilir? Sorusuna, pek çok şey plazmid hazırlıkları arasında verim farklılıklarına neden olabilir. Bu gizemi madde madde çözelim ve neler yapabileceğimizi gözden geçirelim.
1. Sorunlu Insertler
Aynı protokolü kullanarak aynı anda iki plazmid hazırladınız ve farklı verimler elde ettiniz. Plazmidler aynı ‘’omurgaya’’ sahipse o zaman sebep, bir insert olabilir. Bazı insertler bakteri için sorunlu olabilir; örneğin bakterileri hasta eden bir protein veya tekrarlayan diziler gibi kararsız olabilir. Sorunun üstesinden gelmek için özel hücre hatları kullanmayı deneyebilirsiniz.
2. Kopya Sayısı
İkinci önemli nokta, insert boyutunun plazmidin kopya sayısını nasıl değiştirdiğidir. Büyük insertler, plazmidin kopya sayısını azaltacaktır, yani iyi bir verim elde etmek için daha fazla hücre büyütmeniz gerekecektir.
Genler farklı vektörlere klonlanırsa, sorun plazmidlerin farklı hızlarda kopyalanması olabilir. Biri yüksek kopyalı bir plazmid olabilir, diğeri orta ve hatta düşük kopyalı bir plazmid olabilir.
3. Kültür Doygunluğu
Kültürü hazırlarken her zaman iyi sonuç alınır. Eski kolonilerden aşılama veya kültürün çok doygun hale gelmesi plazmid verimini ciddi şekilde negatif olarak etkileyecektir. Kültürlerin geç gecikme evresinde olmasını ve aşırı doygun olmasını istemeyiz.
4. Eski Kolonilerin Kullanılması
Başlangıç kültürleri oluşturulurken kullanılan petrinin yaşı önemlidir. Petriniz eskiyse güzel ve büyük bir koloni seçmiş olsanız bile hepsi canlı hücreler olmayacaktır. Bu nedenle en iyi sonucu elde etmek için başlamadan önce yeni bir petride saflaştırın.
5. Antibiyotik Sorunları
Zayıf plazmidin bir diğer nedeni de antibiyotiklerdir. Bakteriler kültürde büyürken antibiyotiği parçalarlar. Yeterli antibiyotik eklenmediğinde veya stoklar eski ve güçleri yeterli değilse antibiyotik çok baskın olamayabilir bunun sonucunda antibiyotik içermeyen bir kültüre sahip olabilirsiniz.
6. Lizis ve Nötralizasyon Problemleri
Lizis içeriğindeki bazı reaktifler çoğunlukla iyi ve stabildir. Ama havaya maruz kaldıklarında zamanla bozulabilirler ve ilk günkü kadar iyi çalışmayabilirler.
Çalışanların plazmid izolasyonunda yaptıkları en büyük hatalarından biri ise parçalama işlemleridir. Protokoller normalde nazik olmanızı söylese de fazla hassas olmak çok da iyi bir durum değildir.
Diğer bir yaygın sorun, lizisin çok uzun süre devam etmesine izin verilmesi ve bunun kalıcı olarak denatüre, olmuş sindirilemez DNA ile sonuçlanmasıdır.
7. İzopropanol Kalitesi
Birçok laboratuvarda, yıl boyunca açılıp kapatılan büyük şişelerde izopropanol bulunur. Çöktürme basamağından iyi verim elde etmek istiyorsak kullanılan izopropanolün eski olmadığından emin olmalısınız.
8. Peleti Kaybetmek
İzopropanol peletleri camsı ve berraktır, görülmesi zordur. Bunla ilgili en iyi uygulama sabit açılı bir rotorda santrifüjlemeden sonra peletin oluşmasını beklediğiniz noktayı işaretlemek olabilir. Böylece izopropanolü döktüğünüzde plazmidi nerede bulacağınızı bilirsiniz.
Sabit açılı bir rotor kullanırken peletinizin nerede olduğunu bilmenizi sağlamanın bir başka yolu da tüplerinizi hep aynı şekilde yüklemektir, bu durumda peletiniz her zaman aynı yerde olacaktır.
!! Pek çok ticari kit üreticisinin bu sorun için geliştirdiği ‘’çökelticiler’’ veya silika disk filtreleri kullanılan kitler ürettiğini belirtmek isteriz.
!! Yine küçük bir not; santrifüjleme süresini ve hızını optimize edilenden kısa tutmamanızı öneriyoruz. Santrifüjleme hızını arttıramıyorsanız süresini asla kısaltmayınız.
9. Kolonların Tıkanması
Kolonların tıkanmasından endişe ediyorsanız kolon basamağına geçmeden önce Whatmankağıdından süzün.
10. Kolonlarda Kalan DNA
Elüsyondan sonra DNA kolonlarda kalabilir. Kalan DNA’yı süzmek için ayrı bir elüsyon daha gerçekleştirin. 50°C civarında ısıtılmış elüsyon tamponu kullanmak da elüsyon verimini artırmaya yardımcı olabilir.
Referanslar:
Maniatis, T., Fritsch, E. F. and Sambrook, J. Molecular cloning. New York: Cold Spring Harbor Laboratory; 1982. pp 545.
Begbie S. et al. (2005) The Effects of Sub-Inhibitory Levels of Chloramphenicol on pBR322 Plasmid Copy Number in Escherichia coli DH5?. Journal of Experimental Microbiology andImmunology (JEMI). 7:82-8.
DNA uzun yıllar uygun koşullarda saklandığında stabil kalabilirken RNA kısa ömürlüdür. Çünkü her türlü koşulda bulunabilen ‘’RNaz’’ adı verilen enzimler RNA’nın bozulmasına sebep olur. Bu nedenle hücrelerden toplam RNA’nın izolasyonunu yüksek verimle yapabilecek aynı zamanda RNA’nın bozulmasını da engelleyecek bir yöntem gereklidir.
Toplam RNA nedir?
Toplam RNA, bir hücrenin içinde bulunan tüm RNA molekülleridir. Tüm prokaryot ve ökaryot hücreleri aşağıdaki türleri içerir:
Messenger RNA (mRNA): Belirli koşullar altında hücresel gen ekspresyonunun anlık okunması olarak hizmet eden uzun protein kodlayan ve DNA’ya taşıyan haberci RNA’dır.
MikroRNA (miRNA): Birçoğu gen ekspresyonunun düzenlenmesi ve susturulmasında yer alan sayısız diğer kodlayıcı olmayan RNA molekülüdür.
Ribozomal RNA (rRNA): Ribozomların önemli bir bileşenidir ve protein sentezi için kritiktir.
Transfer RNA (tRNA): Protein sentezi için başka bir kritik bileşendir. Bir öncü molekülün nükleusta işlenmesiyle oluşur. Bu RNA molekülleri, sentezlenen proteine doğru amino asidin eklenmesini sağlamak için amino asitleri ribozoma ve baz çiftine mRNA ile taşır.
RNaz Nedir?
Ribonükleazlar (RNazlar), RNA’yı parçalayan enzimlerdir. Bu enzimler RNA izolasyonu sırasında çok sorun yaratırlar, çünkü her yerde ama her her yerde bulunurlar ve ortadan kaldırılmaları da çok zordur. Toplam RNA izolasyonu yaparken RNAazı elemine ettiğinizden emin olmanız gerekir.
Toplam RNA İzolasyonunda RNazları Trizol Kullanarak Uzaklaştırmak
RNaz’ları etkisiz hale getirmek elbette ki imkânsız değildir. RNaz’ları inhibe ederken aynı zamanda RNA’ları da güvenli bir şekilde izole etmeyi sağlayan ilk yöntemi PiotrChomczynski ve Nicoletta Sacchi tarafından uygulanan Guanidinium tiyosiyanat-fenol-kloroform izolasyon yöntemidir. Bu yöntem, protein hücre bileşenlerini parçalayan ve RNazlar dahil tüm enzimleri inaktive eden güçlü bir protein denatüre eden kimyasal bileşenlerden oluşan bir formdur. İzolasyonu tipik olarak toplam RNA’yı berrak bir sulu fazda sınırlamak için asidik fenol-kloroform kullanılır, proteinler ve hücre kalıntıları ise pembe organik katmanda son bulur. RNA, izopropanol ile çökeltilerek geri kazanılabilir, yıkanabilir ve daha sonra suda yeniden çözülebilir. Bu yöntemin hazır formda olan birçok markası vardır. Ve kendi fenol guanidin izotiyosiyanat karışımınızı da yapmanız mümkündür.
Toplam RNA izolasyonu için Trizol’ün Faydaları
RNazların denatüre edilmesi.
miRNA gibi küçük moleküler ağırlıklı RNA’lar da dahil toplam RNA’nın izolasyonu
Yüksek kaliteli RNA.
Kullanımı nispeten basit.
Bir numuneden aynı anda DNA, protein ve RNA izolasyonuna izin verir.
Trizol Kullanmanın Dezavantajları
Diğer RNA izolasyonu yöntemleriyle karşılaştırıldığında maliyetli olabilir,
Tehlikeli ve toksiktir,
Dikkatli çalışılmaz ise izole edilmiş RNA faz ayrımı esnasında fenol ile kontamine olabilir,
Zaman alıcı olabilir.
RNA izolasyonu için Trizole Alternatik Olarak Kullanılan Ticari Kitler
Trizol veya diğer tehlikeli kimyasalları kullanmayan birçok ticari kit vardır. Bugün günümüzde neredeyse tüm uygulamalar için uygunluk gösterebilen ticari kitler mevcuttur. Bu kitler RNA’yı yakalamak için spin kolon ya da manyetik boncuk yöntemlerini kullanabilir. miRNA veya diğer küçük moleküler ağırlıklı RNA türleri için de özel olarak tasarlanmış kitler bulunmaktadır. Kit metotları çoğu zaman farklı kaynak ve materyallerden RNA çıkarmak için optimize edilmiş oldukları için Trizole göre daha güvenli ve stabildirler.
ÖZET
Trizol ve ticari olarak temin edilebilen kit metotlarının maliyet, tehlikeli kimyasalların kullanımı ve uygunluk açısından artıları ve eksileri vardır ve bunların her biri seçilmeden önce dikkatlice düşünülmelidir.
Artık ameliyathanelerde doktorlar robotik kodları birkaç nanometre hassasiyetle yönlendirebiliyorlar ve hastaları bilgisayar ekranlarından uzaktan ameliyat edebiliyorlar.
Sadece bir polipeptit zincir dizisi olan DNA ekleme enzimleriyle donatılmış genetik laboratuvarları harikalar yaratabilir. İnsanların tüm genetik yapısı, anlaşılabilir genetik kodlara dönüştürülebilir.
Tıbbi Biyoteknoloji, son birkaç yılda büyük sıçramalarla ilerlemiştir. Bu yazıda, tıpta biyoteknolojinin bazı atılımlarını listelemek için yola çıktık.
1. Kök Hücre Araştırmaları
Kök hücreler, bir organizmanın erken gelişimi sırasında sonsuza kadar bölünmeye devam edebilir ve vücut hücrelerine farklılaşma kapasitesine sahiptir. Bir laboratuvarda, araştırmacılar bu kök hücreleri belirli hücre türlerine farklılaşmak üzere programlayabilirler. Biyoteknoloji inovasyonunun devreye girdiği yer burasıdır. Yaşam kalitelerini ciddi şekilde etkileyen dejeneratif disk bozukluğu olan bir birey hayal edin. Kök hücre araştırmalarının yardımıyla, bu kök hücreleri laboratuvar ortamında in vitro büyütmek ve daha sonra etkilenen kişinin vücuduna geri yerleştirmek mümkün olabilir. Bu onların bilişsel keskinliklerini, görmelerini, duymalarını ve diğer fiziksel özelliklerini geri kazanmalarına yardımcı olacaktır. Bu kulağa biraz bilim kurgu filmi gibi gelse de umut vericidir.
2. İnsan Genom Projesi
Genellikle insanlık tarihinin en büyük keşiflerinden biri olarak övülen İnsan Genom Projesi (HGP), Ulusal Sağlık Enstitüleri ve ABD Enerji Bakanlığı tarafından koordine edilen uluslararası bir bilimsel araştırma projesiydi. İnsan DNA’sını oluşturan nükleotid baz çiftlerinin sırasını belirlemek amacıyla 1990 yılında başlatıldı. Nisan 2003’te araştırmacılar, tüm insan genomunun ön dizilimini tamamladıklarını açıkladılar. Araştırmacılar genlerin ve proteinlerin işlevleri hakkında daha fazla şey öğrendikçe, hastalıklara neden olan genleri tanımlamalarına yardımcı oldu.
3. Hedefe Yönelik Kanser Tedavileri
Standart kemoterapiler sağlıklı hücreler için toksiktir. Hedefe yönelik kanser tedavileri, sağlıklı hücrelere verilen zararı en aza indirmek için ya belirli moleküllerin işlevine müdahale ederek ya da yalnızca bilinen kanserli hücreleri hedefleyerek çalışan ilaçlardır. Ulusal Kanser Enstitüsüne göre, “Sonunda, tedaviler hastanın tümörü tarafından üretilen benzersiz moleküler hedeflere dayalı olarak kişiselleştirilebilir.”
4. Ameliyat için 3D Görselleştirme
Cerrahi, insan vücudu için acımasızdır ve iyileşme sürecini daha verimli hale getiren tıbbi atılımlar her zaman memnuniyetle karşılanır. Biyoteknoloji artık doktorların MRI ve CT taramaları kullanarak bir hastanın vücudunun içinin tüm 3D görüntüsünü görüntülemesini mümkün kıldı. Ayrıca, artırılmış gerçeklik, ilgili bilgilerin ilgili vücut bölümleri üzerinde doğrudan üst üste bindirilerek görüntülenmesine izin verecektir.
5. HPV aşısı
İnsan Papilloma Virüsü (HPV), rahim ağzı kanserine neden olan etkenlerden biridir. Kadınlarda en ölümcül ikinci kanserdir. Bu nedenle, başarılı bir HPV aşısı büyük bir tıbbi başarı olarak kabul edilir. ABD Gıda ve İlaç Dairesi (FDA), bazı PV aşılarının 9 – 26 yaş arasındaki kadınlarda kullanılmasını onaylamıştır.
6. Yüz Nakli
Yüz nakli, hastanın yüzünün tamamını veya bir kısmını bir donörün yüzüyle değiştirmek için deri greftleri kullanma işlemidir. İlk kısmi yüz nakli 2005 yılında Fransa’nın Amiens kentinde yapıldı. Bir sonraki başarılı yüz nakli ise beş yıl sonra İspanya’da yapıldı; bu aynı zamanda ilk tam yüz nakliydi. Bir kaza sonucu yüzü ağır hasar gören nakil hastası, 24 saat süren ameliyatta yeni bir burun, dudak, diş ve elmacık kemiklerine kavuştu.
7. CRISPR
Daha önceki bültenlerimizde daha detaylı yer verdiğimiz, Kümelenmiş Düzenli Olarak Serpiştirilmiş Kısa Palindromik Tekrarlar (CRISPR), tıbbi araştırmalarda çığır açan bir araç olarak selamlanan nispeten yeni bir gen düzenleme sistemidir. Araştırmacılar, yeni bulunan mutasyonları aktif olarak test ederek ve hedeflenen tedavileri düzeltmek için sürekli olarak genetik mutasyonlara ayak uydurabilirler
8. 3D Baskılı Organlar
Yapay uzuvlar yüzyıllardır kullanılmaktadır ve biyonik uzuvların hareketliliği ve çok yönlülüğünde sürekli bir gelişme olmuştur. Şimdi biyonik teknolojideki ve 3D baskıdaki yeni gelişmeler onu daha da ileri götürdü. Kalp, böbrek ve karaciğer gibi iç organların yapay olarak inşa edilmesini mümkün kılmıştır. Doktorlar bunları başarılı bir şekilde ihtiyaç duyan bireylere yerleştirmeyi başardılar.
9. Sinir Rejenerasyonu
Nörodejeneratif hastalık ve omurilik yaralanmasından kaynaklanan sinir hasarı, büyük ölçüde geri döndürülemez olarak bilinir. Bununla birlikte, araştırmacılar, yaralı sinir hücrelerinin yenilenmesini ve büyümesini destekleyen nadir enzimlerin sentezlenmesinde önemli ilerleme kaydetmiştir. Nörotrofinler, nöronların gelişimini destekleyen proteinlerdir. Güçlü nörotrofiközelliklere sahip küçük moleküler zincirlerin bir dizisidir. Bu nörotrofinler, protein bazlı ajanların bazı eksikliklerine sahip olsa da, araştırmacılar bunu sinir rejenerasyonu için olası bir yol olarak takip ediyor.
10. Beyin Sinyallerini Konuşmaya Çeviren Teknoloji
Bilim insanları, bir ses sentezleyici kullanarak beyin sinyallerini sesli konuşmaya çevirebilen bir cihaz geliştirmeye çalışıyorlar. Bu, hastalık veya travmatik yaralanmalarla felç olmuş bireylerle iletişim kurmada inanılmaz bir araç olarak hizmet edecektir. Ayrıca bilim insanları, bu cihazları epileptik hastalarda nöbetlerinin kaynağını izole etmek için kullanabileceklerini bulmuşlardır.
Referans: https://explorebiotech.com
Artan termal kararlılık ve hibridizasyon özgüllüğü
qPCR-dPCR analizlerinde doğruluğu ispatlanmış gen tanımlama
Tek yolla alleller arası (SNP) ayrım yapabilme yeteneği
Sorunlu hedef diziler için daha kolay ve esnek tasarımlar
Türkçe’de ‘Kilitli Nükleik Asitler (KNA)’ olarak ifede edilen LNA’lar yararlı sentetik RNA türevidir. Aynı zamanda köprülü nükleik asit (BNA) olarak da bilinir. Ve genellikle erişilemez RNA olarak adlandırılır. Şeker-fostaf ana hattında 2′-oksijen ve 4′-karbon atomlarından metilen köprüsü ile sınırlı ve bu bağlantı seker halkasını DNA ve RNA sekanslarına komplementer hibrid olusumuna müsade eden 3′-endo konformasyonuna sabitler. Bu sayede LNA, RNA taklidi ile konformasyona kilitlenmistir. Bu yapı enzimatik bozunmaya karşı stabilitenin artmasını sağlar. Ayrıca LNA’nın yapısı bir monomer ya da oligonükleotidin bir bileşeni olarak gelişmiş özgünlük ve afiniteye sahiptir.
LNA’lar birçok real-time PCR ve dijital PCR uygulamasında kullanılmaktatıdır, ayrıca bir ekipmanın gerekliliği söz konusu değildir ve tüm cihazlarla uyumuluk gösterir. LNA oligonükleotidleri, DNA oligonükleotitlerine dahil edildiğinde, doğal durumdaki DNA bazlarına kıyasla bazı faydaları sunar:
• Geleneksel problara göre uyumsuzluk ayrımları daha azdır.
• Kısa DNA primerlerine (< 30 nt) dahil edilmesi ile ikame edilmiş her nükleotit için Tm’yi 3-8 °C arttırır. Artan hibridizasyon sıcaklığı ile diziye yapısal stabilite kazandırır.
• Genotipleme ve transkript varyant tespiti veya mikrobiyal türlerin diferansiyel tespiti gibi özel uygulamalar için yaygın olarak kullanılır.
• LNA’ların yüksek nükleaz direnci, in vivo ve in vitro uygulamalar için önemli bir faydadır. Sayısız çalışmalar LNA’nın antisens ajanları olarak üstün özelliklerini doğrulamaktadır
• Diagnostic alanlarında LNA ile yapılan çalışmalar vardır.
• İmmobilize LNA probları, multipleks SNP genotipleme analizlerinde başarılı bir şekilde sunulmuştur. Bu, LNA’ların gelecekte piyasada çok daha fazla varolacağının göstergesidir.
Her PCR reaksiyonunun sorunu aynıdır:
Hedef DNA’nın çok az amplifikasyonuna rağmen hedef dışı DNA’ların daha fazla amplifikasyona uğraması. Ancak bazı ek reaktifler kullanarak PCR reaksiyonlarınızın sorununu çözebilirsiniz. Hangi PCR reaktifinin ne işe yaradığını ve sizin için en iyi koşulu belirleyebilmek sizin elinizdedir.
PCR ek reaktifleri genellikle aşağıdaki iki yoldan biri ile çalışır:
① İkincil yapıları azaltıp hedef DNA’nın amplifikasyonunu arttırarak ↑
② Spesifik olmayan bağlanmaları azaltıp hedef dışı DNA’ların amplifikasyonunu azaltarak ↓
• Magnezyum Etkisi
Polimeraz aktivitesi için Mg⁺² gereklidir. Yeterli Mg⁺² olmadığında taq polimeraz inaktifhalde kalır. Doğru Mg⁺² konsantrasyonu özgünlüğü arttırır. Düşük Mg⁺² konsantrasyonu spesifik olmayan bağlanmaları arttırır.
• BSA
Sığır serum albümin, çeşitli moleküler biyoloji uygulamalarında, özellikle de restriksiyon enzim sindirimleri ve PCR’de yaygın olarak kullanılan bir ilavedir. PCR’de BSA, fenolik bileşikler gibi kirleticilerle mücadelede yardımcı olabilir. Ayrıca reaksiyon bileşenlerinin tüp duvarlarına yapışmasını önlediği de bildirilmektedir.
• Betain
GC açısından zengin ve zor DNA hedeflerinde amplifikasyonu geliştirir. Amplifiye edilmesi zor olduğu bilinen dizilerde kullanımı idealdir. DNA Tm sıcaklığını düşürülmesini sağlar.
• İyonik olmayan Deterjanlar
Triton X-100, Tween 20, NP-40 gibi kimyasal bileşenlerin kullanımı da ikincil yapıları azalttığı düşünülmektedir. Bu reaktiflerin kullanımı PCR verimini arttırabilir fakat spesifik olmayan amplifikasyonları da arttırabilir. Bundan dolayı dikkatli kullanılmalıdır.
• DMSO
İkincil DNA yapılarını azalttığı düşünülür. Bundan dolayı GC içeriği zengin yapıların PCR analizi yapılırken eklenmesi önerilebilir. Ancak DMSO, Taq polimeraz aktivitesinin düşmesine de neden olabileceğinden aralarındaki dengenin kurulması son derece önemlidir.
• Formamide
Organik bir PCR ek reaktifidir. Spesifik olmayan bağlanmayı azaltarak kirli PCR reaksiyonlarını temizlemek için çalışır.
Tüm bu bileşenler PCR sonuçlarını iyileştirse de analiziniz için en iyisinin ne olduğunu ilk aşamada tahmin etmek mümkün değildir. Bir PCR reaksiyonunu optimize edebilmek için çok fazla deneme yapmak gerekir.
Gen sürücüsü, genlerin tipik kalıtım kurallarına uymamaları için değiştiren bir tür genetik mühendislik tekniğidir. Doğal olan bir geni, daha sonra nesilden nesile aktarılan yeni bir genle değiştirerek doğal seçilimin geçersiz kılınmasını sağlar.
Gen sürücüsünün potansiyel kullanımları ve etkileri nedeniyle, uluslararası düzeyde bu teknolojiye artan bir ilgi vardır.
Nasıl Çalışır?
Gen sürücüsü üç anahtar bileşenden oluşur:
• Yaymak istediğiniz gen,
• DNA’yı kesebilen Cas9 enzimi,
• Enzimin nerede kesmesi gerektiğini belirleyen, CRISPR.
Bu üç elementi kodlayan genetik materyal, her iki kromozomda da değiştirmek istediğiniz doğal olan genin yerine bir hayvanın DNA’sına eklenir. Bakterilerden yararlanılan gen düzenleme teknolojisi CRISPR-Cas9 sayesinde, araştırmacıların gen sürücülerini oluşturması daha kolay hale geliyor.
NOT: CRISPR-Cas9 ile ilgili bilgilerinizi güncellemek için Letgen Biyoteknoloji’ninyayınladığı Mart ayı bültenini inceleyebilirsiniz.
Gen sürücüsünü taşıyan hayvan ile taşımayan hayvan ile çiftleştiğinde bir ‘’doğal versiyon’’ ve bir de ‘’gen sürücüsü versiyonu’’ olacak şekilde DNA kopyası alır. Döllenme sonrası kromozomlar ilk kez sıralandığında; gen sürücüsü DNA’sındaki CRISPR etkinleşir ve DNA’yı kesen Cas9 enzimi gelişim başlamadan önce doğal olan versiyonun kopyasını kesmesi için yönlendirilir. Doğal gen kesildiğinde hücrenin onarım mekanizmaları tetiklenir ve hasarlı DNA eski haline getirilir. Ancak şablon olarak gen sürücüsünü taşıyan kromozomu kullanır. Sonuçta onarım bittiğinde her iki kromozom da gen sürücüsünün bir kopyasını taşır.
Bu şekilde nesilden nesile aktarım sağlanır. Ve süreç böyle devam eder…
Crisanti ve Burt adında iki bilim insanı yıllardır sivrisinekler üzerinde çalışmalar yapıyorlardı. Doğal seçilimi es geçip mutasyonlardan çok hızlı yayılan bir geni sokmak istediler. Buradaki amaçları hastalık yaymalarını engelleyerek sivrisinekleri yok etmekti. Sonunda sivrisinek genomuna ekledikleri bir gen, popülasyon boyunca ilerleyerek neslin %85’inden fazlasına ulaştı.
Ancak bilim insanları, bir türün tamamını ortadan kaldırmak için gen sürücülerinin kullanılmasının ekolojik ve çevresel etkilerini belirlemek için hala çalışıyorlar.
Tehlikeli midir?
ABD’de yapılan birçok anket göstermiştir ki teknolojinin risk ve yararları hakkında yeterli bilgi sağlandığında halkın çoğunluğunun zararlılara karşı tarımsal gen sürücülerinin kullanımını destekleyeceği yönünde olmuştur.
Gen sürücüsü projelerinin ekolojik etkilerini ayrıt etmek bilim insanları hala için zordur.
İstenmeyen sonuçların ortaya çıkması durumunda, gen sürücüsünün çevreden uzaklaştırılması için potansiyel iyileştirme planları veya iyileştirme stratejileri üzerine çalışmalar da devam etmektedir.
İnsan sağlığını ve ekolojik dengeyi sağlayabilmek için gen sürücüleri umut vadetse de teknolojinin çıkarımları ve etkinliği üzerine gidilecek çok yol var gibi görünüyor.
PCR başarısı, deneysel tasarımınıza bağlı olarak değişebilir.
Küçük hatalar genellikle düşük verim veya yanlış negatif/pozitif ürünlerle sonuçlanabilir.
PCR reaksiyonunuzun başarısını sağlamak için 4 temel ipucu:
1. Primer Tasarımı
• En uygun primer konsantrasyonunu bulun.
• İkincil yapı oluşumunu önlemek için 18-30 nükleotid uzunluğunda bir primer ve %40-60 GC içeriği önerilir.
• Primer homolojisini kontrol edin. Primerleriniz arasında veya dahili olarak herhangi bir bağlanma, PCR verimliliğinin düşmesine neden olacaktır.
• Primerlerin bağlanma dereceleri 2 (A+T)+4 (G+C) formülü ile hesaplanır.
• Bir G veya C ile bitirin. Primer dizinizin 3′ ucunu bir G veya C ile kapatmak, uzatma bölgesinde primer uzamasını güçlendirecektir.
2. Hedef Dizi
• Bir PCR reaksiyonu, DNA şablonunuzun hem kalitesinden hem de miktarından etkilenebilir.
• Kaliteli bir DNA dizisi, reaksiyonun özgülüğünü ve ürün verimini arttıracaktır.
• Kontaminasyonu önlemek için dikkatli olun! Protein ya da kimyasal kontaminasyon, spesifik olmayan bağlanmalara neden olabilir veya PCR’ı tamamen inhibe edebilir.
• DNA absorbansınızın 260nm/280nm oranının ≥1.8 olduğunu kontrol edin.
3. Reaksiyon Reaktifleri
• Tehlikeli reaktifler PCR reaksiyonunuzun verimliliğini etkiler. Birçok laboratuvarda hazır ticari bileşenler kullanılsa da bilinmesi gereken ve dikkate alınması gereken bileşenler:
DNA Polymerase, dNTP, magnezyum konsantrasyonu.
4. Termal Profil
• Thermocycler protokolleri ve koşulları, PCR için oldukça standardize edilmiştir. İşte dikkate alınması gereken üç ana husus:
» Modifiye edilmiş PCR koşulları:
» Bağlanma Sıcaklığı: primer diziliminizin erime sıcaklığından 3 °C’de altında ayarlamanızı en uygunu olacaktır. Daha ileriki optimizasyon için anneling sıcaklığı 1-2 °C’lik adımlarla arttırılabilir.
» Uzatma süresi: Her 1 kb amplikon için 1 dakikalık uzatma süresi ayarlamanız önerilir. Optimal uzama oranları, DNA polimerazın işlenebilirliğine bağlı olabilir.
Primer/Probe Nedir?
Primerler (Oligonükleotid), kısa nükleotid dizileridir. Birçok moleküler ve genetik işlemlerde kullanılmaktadırlar. Nükleik asit probeları, hibridizasyon yoluyla spesifik nükleik asitsekanslarını tespit etmek için çok önemli reaktiflerdir. Çözelti halinde veya katı faza eklenmiş spesifik bir hibridize probeun görselleştirilmesi, hibridizasyon testinin temel prensibidir.
Üretilen primer ve probeların oligonükleotid dizisine spesifik olup olmadığı kalite kontrol testleri ile kontrol edilmelidir. Primerleri saflaştırma işlemleri olarak, standart desalted(DSLT) saflaştırma ve HPCL saflaştırma seçenekleri sunulabilir. Hangi saflaştırma yöntemi tercih edilirse edilsin PCR işleminde kullanılan son konsantrasyona göre sarfiyat değişkenlik gösterecektir. Bundan dolayı da hazırlanan sentez skalasına göre verilen tahmini PCR reaksiyon sayısı oldukça değişkenlik göstermektedir.
Liyofilize olarak gelen primer/probelar sıcaklık değişimlerinden etkilenmediği için oda sıcaklığında saklanabilir. Sulandırılma işlemi yapıldıktan sonra -20 ºC’de saklanmalıdır. Uzun süreli kullanımlar için don-çöz yapılmamalı ve aliquotlanarak kullanımı gerçekleştirilmelidir.
Primer/Probe Sulandırma İşlemi Nasıl Yapılır?
Oligonükleotidleri çözma işlemi için TE (Tris-EDTA tampon çözeltisi) veya DNaz/RNaziçermeyen su (DNase/RNase free water/DEPC water) kullanılır.
• 100 μM = 100 μMoles/L = 0.1 nMoles/μL
• Ana stok = 100 μM
Amount of Oligo
34.0 = 155.5 = 0.96
OD 260 nMoles mg
• 100 μM = X nmol liyofilize primer + (X × 10 μl H2O)
• Örneğin; 155.5 nmol primer varsa 1555 μl H2O eklenerek 100 μM primer ana stok oluşturulur.
• Çalışma stoğu = 10 μM olacak ise
• Primer ana stoğunu, H2O ile 1:10 steril mikrosantrifüj tüpünde seyreltilir.
Transcription Activator-Like Effector Nucleases
TALEN ilk olarak 2009’da keşfedildi ve 2011’de genom düzenleme çalışması için başarıyla kullanıldı.
TALEN’ler (Transkripsiyon Aktivatör Benzeri Efektör Nüklezlar) adı verilen proteinler, başarılı enfeksiyonlarını destekleyen bitki konakçılarındaki genleri açan transkripsiyon faktörleri olarak işlev görür.
TALEN’ler enfeksiyon sırasında bitki genlerini kontrol etmek için zararlı bitki bakterileri tarafından yapılan ve kullanılan doğal proteinlerdir.
TALE’ler, genellikle bitki hastalıklarıyla ilişkilendirilen bir gram-negatif Proteobacteria cinsi olan Xanthomonas spp.’den bir tip III efektör protein ailesini temsil eder. Bu akıllı mikrobiyal yaratıklar, bitkilerdeki gen ekspresyonunu kontrol etmek için, öncelikle TALE’ler aracılığıyla kendi yollarını geliştirdiler.
Figür: TALE’nin yeniden yapılandırılmasına ilişkin şemalar. Merkezi bağlanma alanı, tekrarlanan amino asit dizilerinin birden çok bölgesini içerir (12 ve 13 konumları, spesifik nükleotid tanıma için en önemli olanlardır). DBD, DNA bağlanma alanı. FokI, Fok 1 nükleaz.
Yapısı
Bir TALE, her biri genellikle 34 amino asitten oluşan art arda tekrarlanan bölümlerden oluşur. Bu amino asit çiftlerinin her biri, DNA’daki belirli bir nükleotide bağlanır. Bu genellikle o genin transkripsiyonunu güçlendirir.
Değiştirilmek istenen bölgenin nükleotid dizisi biliniyorsa, ona karşılık gelen tekrar dizisi birleştirilerek bir TALE sentezlenebilir. Bu yapıya, TALE’nin bağlandığı DNA’yı kesebilen bir endonükleaz eklenir.
TALEN, genomunu değiştirmek istediğiniz hücrenin çekirdeğine girdikten sonra, çift sarmallı bir kırılma (DSB) oluşturan DNA’yı keser. Bu, homolog olmayan uç birleştirme (NHEJ) veya homolog rekombinasyon (HR) ile onarılabilir.
TALEN’in arkasındaki anahtar teknoloji, belirli bir DNA dizisini bağlamak için transkripsiyon aktivatör benzeri efektörlerin (TALE) kullanılmasıdır. FokI gibi bir nükleaz ile birleştirildiğinde, kesme bölgesinin hassasiyeti son derece etkili hale gelir.
Uygulamalar
• Şimdiye kadar, TALEN’ler birçok türde genleri değiştirmek için kullanılmıştır: bitkiler, hayvanlar, mantarlar ve maymunlar.
• Hücre hatları kullanılarak yapılan in vitro mutagenez çalışmaları
• In vivo genom düzenleme
• Biyoyakıt olarak kullanım içi şeker kamışı
• Mahsul iyileştirme uygulamaları
TALEN’ler mahsullerimizi iyileştirmek için nasıl kullanılır?
TALEN’ler bilim adamları tarafından gıda mahsullerinin iyileştirilmesine yardımcı olmak için kullanılır.
TALEN’ler ürünlerin özelliklerini genişletmek için kullanılan bir araçtır ve yetiştiricilerin istedikleri nitelikleri seçici olarak değiştirmelerine izin verir; artan verim ve kalite, lezzetli gıdalar, hastalık. Çevresel faktörlere karşı direnç gibi.
Bugüne kadar üstün kaliteli yağ üreten soya fasülyesi, bakteriyel yanıklığa daha dayanıklı ve aromatik olan pirinç, daha iyi tat ve daha az kanserojen akrilamide sahip patates, küllenmeye karşı tam dirençli buğday üretimleri TALEN’ler sayesinde üretilebilmiştir.
Öngörülen 10 milyar nüfusu 2050 yılına kadar beslemek için gıda üretimini ikiye katlama ihtiyacıyla, TALEN’ler ve diğer yeni ıslah yenilikleri, gıda güvenliğini sağlamak için temel araçlardır.
Bitkilerin ve alglerin dışında, TALEN’ler maya, meyve sineği, yuvarlak kurt, cırcır böceği, zebra balığı, kurbağa, sıçan, domuz, inek, ipekböceği ve insanlarda genleri değiştirmek için başarıyla kullanılmıştır.
Sonuç
TALEN’ler günümüzde en spesifik gen düzenleme aracı olmaya devam etmektedir.
TALEN’ler, herhangi bir diziyi hedefleyebilen ve bazı durumlarda CRISPR’den daha iyi performans gösterebilen son derece hassas gen düzenleme araçlarıdır.
Bununla birlikte teknoloji, tasarlanmış proteinlerin oluşturulmasını gerektirmektedir.
Teknoloji iyi kurulmuş, kanıtlanmış ve spesifik olmasının yanında, protein mühendisliği zaman alıcı ve pahalı sistemlerdir. Sadece bir kısmının yüksek performansı vardır. Ve eş zamanlı düzenlemeler yapmak zordur.
TALEN’ler moleküler genom mühendisleri için harikadır ver geçen gün TALEN’ikullanmanın daha yeni ve daha iyi yolları ortaya çıkacaktır.
Nedir bu CRISPR-Cas9?
CRISPR kümelerinin varlığı 1980’lerden beri bilinse de canlının savunma mekanizmasındaki rolü görece yeni kanıtlanmış durumda. 2013 yılından itibaren tüm bilim dünyasının ilgi odağı olan CRISPR-Cas9 sistemini kullanarak gen düzenleme teknolojisi Science dergisi tarafından bile bugüne kadar insanlığın keşfetmiş olduğu en hızlı, en başarılı, en ucuz ve yüksek doğruluk oranına sahip genom değiştirme yöntemlerinden birisi olarak tanımlanmıştır.
CRISPR (clustered regularly Interspaced short palindromic repeats = düzenli aralıklarla bölünmüş kısa palindromik tekrar kümeleri) /Cas9 (CRISPR ile ilişkili nükleaz-9), kısa tekrarlı baz dizileri içeren prokaryot DNA segmentleridir. Arkeaların tamamında ve bakterilerin yarısında bu sistem bulunmaktadır.
CRISPR-Cas9 nasıl işliyor?
Mutasyonu yaratan iki önemli molekül mevcut:
1. Cas9 adlı bir enzim: Genomun belirli yerlerinden iki DNA iplikçiğini kesebilen “moleküler bir makas” görevi görür. Böylece DNA parçaları eklenebilir veya çıkarılabilir.
2. Rehber RNA (gRNA): Daha uzun bir RNA iskeletin içindeki, önceden tasarlanmış küçük (yaklaşık 20 bazlık) bir RNA diziliminden oluşur. Uzun RNA iskeleti DNA’ya bağlanır ve önceden tasarlanmış dizilim Cas9’un genomun doğru noktasına gitmesine rehberlik eder. Böylece Cas9 enzimi doğru yerleri keser.
• Hedef gRNA içinde bir Protospacer Bitişik Motifi (PAM) bulunmalıdır.
• PAM sekansı aracılığı ile Cas9 enzimi ile ribonukleoprotein kompleksi oluşturan gRNA kompleksinin DNA’ya bağlanmasını sağlar.
• Cas9 rehber RNA’yı izleyerek, DNA’da ilgili yere gider ve DNA’nın iki iplikçiğinde de kesik oluşturur.
• Bu aşamada hücre DNA’nın hasar gördüğünü fark eder ve onarmaya çalışır.
• Böylelikle DNA onarım mekanizması kullanılarak, ilgilenilen hücrenin bir ya da birden fazla geninde değişiklik yapabilir.
Gelecekte neler vadediyor?
• Kanser, HIV, Parkinson, Sıtma, Hepatit, görme kayıplarının düzeltilmesi gibi tedavisi çok zor olan ve mekanizması bilinemeyen birçok hastalığın tedavisinde yüksek potansiyele sahiptir. Bugüne kadar az da olsa hastalıkların tedavisinde bu sistemden faydalanılmıştır.
• Diğer gen düzenleme sistemlerinden çok daha kolay ve hızlı ve az maliyetli olduğu bilinmektedir.
• Üreme hücrelerinde yapılacak olan değişikliklerin nesilden nesile aktarılması ihtimali etik sorunları tetikleyeceğinden insanlar üzerinde kullanılması için uzun zaman var gibi görünmektedir.
• “Hedef dışı” etkilerin elimine edilmesine yönelik yapılan birçok çalışma mevcut. Sistem spesifik olsa da bazı durumlarda hedeflenen gen yerine başka bir noktanın kesilmesi şeklinde hata yapabilme ihtimali hala var.
• 2020 Nobel Kimya Ödülü de dahil olmak üzere birçok ödüle layık görülen sistemin başarışı hala %30’ları geçebilmiş değildir.
Sonuç
CRISPR/Cas teknolojisi, gün geçtikçe daha hassas ve verimli hale gelmektedir ve işlevsel genomik çalışmalar ile ürünlerin özelliklerinin geliştirilmesinde etkili bir araç olarak kullanılmaya devam edecektir.