Plazmidlerin ne olduğundan ve uygulama alanlarından daha önceki bültenlerimizde bahsetmiştik. Plazmid kopya sayılarına daha yakından bakarken laboratuvarda işimize yarayacak yolları inceleyelim.
Bu ayki bültenimizin içeriği;
*Plazmid kopya sayısı tam olarak ne anlama geliyor?
*Plazmid kopya sayısı neden önemlidir?
*Plazmid kopya sayısı nasıl değiştirilebilir üzerine olacak.
Plazmid kopya sayısının verim üzerinde büyük bir etkisi olabilir ve bazen yüksek bir plazmid DNA kopya sayısına sahip olmak en iyisi iken bazı zamanlarda dezavantaj da olabilir.
Plazmid Kopya Sayısı Nedir?
Plazmid kopya sayısı, konak bakteri hücresinde bulunan tek bir plazmidin molekül sayısını belirtir. Düşük (hücre başına 15-20 kopya), orta (hücre başına 20-100 kopya) ya da yüksek (hücre başına 500-700 kopya) kopya sayısı olarak ifade edilirler ve üç ana faktöre bağlı olarak büyüklük bakımından farklılık gösterir.
1) Ori ve bileşenleri (örneğin, ColE1 RNA I ve RNA II).
2) Plazmidin boyutu ve bununla ilişkili eklenti (daha büyük ekler ve plazmidler, hücre için muazzam bir metabolik yükü temsil ettikleri için daha düşük bir sayıda çoğaltılabilir).
3) Kültür koşulları (konakçı üzerindeki metabolik yükü etkileyen faktörler).
Plazmidinizin Kopya Sayısını Bilmek Neden Önemli?
Çalışmaya başlamadan önce plazmidinizin hangi kategoriye girdiğini bilmek çok önemlidir. Düşük kopya sayılı bir plazmidle çalıştığınızı biliyorsanız, düşük çıkan verime çok şaşırmamalısınız ve daha fazla kültür ortamı oluşturmaya karar verebilirsiniz.
Yüksek bir plazmid kopya sayısının bir avantajı, plazmidin daha yüksek stabilitesidir. Ama bunun tam tersi de olmaz diyemeyiz!
Yüksek Plazmid Kopya Sayısı Ne Zaman Önemlidir?
- Protein üretim çalışmaları yaparken düşük protein verimi yaşıyorsanız yüksek kopyalı bir plazmid sayısının muhtemelen metabolik yükünün yüksek olması nedeniyle protein toplanması ve yetersiz bir modifikasyona yol açabilir.
- Klonlama çalışmalarında yüksek plazmid kopya sayısı kullanmak daha yüksek verimle sonuçlanacaktır.
Düşük Plazmid Kopya Sayısı Ne Zaman İyidir?
- Yüksek kopya sayısı her zaman iyi gibi düşünülse de bazı durumlar düşük kopya sayısına daha uygundur. Mesela, bir mantar proteini üzerinde antibakteriyel özellikleri hakkında çalışmak istiyorsunuz; burada toksik etkileri en aza indirmek ve bakterileri öldürmemek için düşük plazmid kopya sayısı ile çalışmak iyi olabilir.
- Aşırı ifade edilen proteinler, yanlış protein-protein eşleşmeleri proteinin kendisinde yapısal sorunlara yol açabilir.
Plazmid Kopya Sayısını Nasıl Değişikliğe Uğratırız?
Yukarıda saydığımız nedenlerden dolayı, çalışmalarınızı yaparken aralarından seçim yapabileceğiniz farklı kopya sayılarına sahip, farklı plazmidlere sahip olmak avantajlı olabilir. Plazmid replikasyonu hakkında yapılan detaylı çalışmalar plazmid kopya sayısını nasıl değiştirmemiz gerektiğinin önünü açmıştır:
- Konak bakteriyi yüksek sıcaklıklarda büyüterek bazı plazmidlerin kopya sayısını arttırabilirsiniz.
- Konak bakterinin kloramfenikole maruz kalması bakteriyel protein sentezini inhibe eder, bu da kromozomal replikasyon inhibisyonuna ve hücre bölünmesi inhibisyonuna yol açar. Plazmidler uzun ömürlü proteinlere ihtiyaç duyarlar replikasyon ve hücre bölünmesi durmuş olsa bile replike olmaya devam ederler. Sonunda ortamda proteinler tükendiğinde plazmid replikasyonu da duracaktır ancak ortalama kopya sayısı önemli ölçüde artmış olacaktır.
