PCR başarısı, deneysel tasarımınıza bağlı olarak değişebilir.
Küçük hatalar genellikle düşük verim veya yanlış negatif/pozitif ürünlerle sonuçlanabilir.
PCR reaksiyonunuzun başarısını sağlamak için 4 temel ipucu:

1. Primer Tasarımı

• En uygun primer konsantrasyonunu bulun.
• İkincil yapı oluşumunu önlemek için 18-30 nükleotid uzunluğunda bir primer ve %40-60 GC içeriği önerilir.
• Primer homolojisini kontrol edin. Primerleriniz arasında veya dahili olarak herhangi bir bağlanma, PCR verimliliğinin düşmesine neden olacaktır.
• Primerlerin bağlanma dereceleri 2 (A+T)+4 (G+C) formülü ile hesaplanır.
• Bir G veya C ile bitirin. Primer dizinizin 3′ ucunu bir G veya C ile kapatmak, uzatma bölgesinde primer uzamasını güçlendirecektir.

2. Hedef Dizi

• Bir PCR reaksiyonu, DNA şablonunuzun hem kalitesinden hem de miktarından etkilenebilir.
• Kaliteli bir DNA dizisi, reaksiyonun özgülüğünü ve ürün verimini arttıracaktır.
• Kontaminasyonu önlemek için dikkatli olun! Protein ya da kimyasal kontaminasyon, spesifik olmayan bağlanmalara neden olabilir veya PCR’ı tamamen inhibe edebilir.
• DNA absorbansınızın 260nm/280nm oranının ≥1.8 olduğunu kontrol edin.

3. Reaksiyon Reaktifleri

• Tehlikeli reaktifler PCR reaksiyonunuzun verimliliğini etkiler. Birçok laboratuvarda hazır ticari bileşenler kullanılsa da bilinmesi gereken ve dikkate alınması gereken bileşenler:
DNA Polymerase, dNTP, magnezyum konsantrasyonu.

4. Termal Profil

• Thermocycler protokolleri ve koşulları, PCR için oldukça standardize edilmiştir. İşte dikkate alınması gereken üç ana husus:
» Modifiye edilmiş PCR koşulları:
» Bağlanma Sıcaklığı: primer diziliminizin erime sıcaklığından 3 °C’de altında ayarlamanızı en uygunu olacaktır. Daha ileriki optimizasyon için anneling sıcaklığı 1-2 °C’lik adımlarla arttırılabilir.
» Uzatma süresi: Her 1 kb amplikon için 1 dakikalık uzatma süresi ayarlamanız önerilir. Optimal uzama oranları, DNA polimerazın işlenebilirliğine bağlı olabilir.

Primer/Probe Nedir?

Primerler (Oligonükleotid), kısa nükleotid dizileridir. Birçok moleküler ve genetik işlemlerde kullanılmaktadırlar. Nükleik asit probeları, hibridizasyon yoluyla spesifik nükleik asitsekanslarını tespit etmek için çok önemli reaktiflerdir. Çözelti halinde veya katı faza eklenmiş spesifik bir hibridize probeun görselleştirilmesi, hibridizasyon testinin temel prensibidir.

Üretilen primer ve probeların oligonükleotid dizisine spesifik olup olmadığı kalite kontrol testleri ile kontrol edilmelidir. Primerleri saflaştırma işlemleri olarak, standart desalted (DSLT) saflaştırma ve HPCL saflaştırma seçenekleri sunulabilir. Hangi saflaştırma yöntemi tercih edilirse edilsin PCR işleminde kullanılan son konsantrasyona göre sarfiyat değişkenlik gösterecektir. Bundan dolayı da hazırlanan sentez skalasına göre verilen tahmini PCR reaksiyon sayısı oldukça değişkenlik göstermektedir.

Liyofilize olarak gelen primer/probelar sıcaklık değişimlerinden etkilenmediği için oda sıcaklığında saklanabilir. Sulandırılma işlemi yapıldıktan sonra -20 ºC’de saklanmalıdır. Uzun süreli kullanımlar için don-çöz yapılmamalı ve aliquotlanarak kullanımı gerçekleştirilmelidir.

Primer/Probe Sulandırma İşlemi Nasıl Yapılır?

Oligonükleotidleri çözma işlemi için TE (Tris-EDTA tampon çözeltisi) veya DNaz/RNaz içermeyen su (DNase/RNase free water/DEPC water) kullanılır.

• 100 μM = 100 μMoles/L = 0.1 nMoles/μL
• Ana stok = 100 μM

Amount of Oligo

34.0 = 155.5 = 0.96

OD 260 nMoles mg

• 100 μM = X nmol liyofilize primer + (X × 10 μl H2O)
• Örneğin; 155.5 nmol primer varsa 1555 μl H2O eklenerek 100 μM primer ana stok oluşturulur.
• Çalışma stoğu = 10 μM olacak ise
• Primer ana stoğunu, H2O ile 1:10 steril mikrosantrifüj tüpünde seyreltilir.

Transcription Activator-Like Effector Nucleases

TALEN ilk olarak 2009’da keşfedildi ve 2011’de genom düzenleme çalışması için başarıyla kullanıldı.
TALEN’ler (Transkripsiyon Aktivatör Benzeri Efektör Nüklezlar) adı verilen proteinler, başarılı enfeksiyonlarını destekleyen bitki konakçılarındaki genleri açan transkripsiyon faktörleri olarak işlev görür.
TALEN’ler enfeksiyon sırasında bitki genlerini kontrol etmek için zararlı bitki bakterileri tarafından yapılan ve kullanılan doğal proteinlerdir.
TALE’ler, genellikle bitki hastalıklarıyla ilişkilendirilen bir gram-negatif Proteobacteria cinsi olan Xanthomonas spp.’den bir tip III efektör protein ailesini temsil eder. Bu akıllı mikrobiyal yaratıklar, bitkilerdeki gen ekspresyonunu kontrol etmek için, öncelikle TALE’ler aracılığıyla kendi yollarını geliştirdiler.
Figür: TALE’nin yeniden yapılandırılmasına ilişkin şemalar. Merkezi bağlanma alanı, tekrarlanan amino asit dizilerinin birden çok bölgesini içerir (12 ve 13 konumları, spesifik nükleotid tanıma için en önemli olanlardır). DBD, DNA bağlanma alanı. FokI, Fok 1 nükleaz.

Yapısı

Bir TALE, her biri genellikle 34 amino asitten oluşan art arda tekrarlanan bölümlerden oluşur. Bu amino asit çiftlerinin her biri, DNA’daki belirli bir nükleotide bağlanır. Bu genellikle o genin transkripsiyonunu güçlendirir.
Değiştirilmek istenen bölgenin nükleotid dizisi biliniyorsa, ona karşılık gelen tekrar dizisi birleştirilerek bir TALE sentezlenebilir. Bu yapıya, TALE’nin bağlandığı DNA’yı kesebilen bir endonükleaz eklenir.
TALEN, genomunu değiştirmek istediğiniz hücrenin çekirdeğine girdikten sonra, çift sarmallı bir kırılma (DSB) oluşturan DNA’yı keser. Bu, homolog olmayan uç birleştirme (NHEJ) veya homolog rekombinasyon (HR) ile onarılabilir.
TALEN’in arkasındaki anahtar teknoloji, belirli bir DNA dizisini bağlamak için transkripsiyon aktivatör benzeri efektörlerin (TALE) kullanılmasıdır. FokI gibi bir nükleaz ile birleştirildiğinde, kesme bölgesinin hassasiyeti son derece etkili hale gelir.

Uygulamalar

• Şimdiye kadar, TALEN’ler birçok türde genleri değiştirmek için kullanılmıştır: bitkiler, hayvanlar, mantarlar ve maymunlar.
• Hücre hatları kullanılarak yapılan in vitro mutagenez çalışmaları • In vivo genom düzenleme
• Biyoyakıt olarak kullanım içi şeker kamışı
• Mahsul iyileştirme uygulamaları

TALEN’ler mahsullerimizi iyileştirmek için nasıl kullanılır?

TALEN’ler bilim adamları tarafından gıda mahsullerinin iyileştirilmesine yardımcı olmak için kullanılır.
TALEN’ler ürünlerin özelliklerini genişletmek için kullanılan bir araçtır ve yetiştiricilerin istedikleri nitelikleri seçici olarak değiştirmelerine izin verir; artan verim ve kalite, lezzetli gıdalar, hastalık. Çevresel faktörlere karşı direnç gibi.
Bugüne kadar üstün kaliteli yağ üreten soya fasülyesi, bakteriyel yanıklığa daha dayanıklı ve aromatik olan pirinç, daha iyi tat ve daha az kanserojen akrilamide sahip patates, küllenmeye karşı tam dirençli buğday üretimleri TALEN’ler sayesinde üretilebilmiştir.
Öngörülen 10 milyar nüfusu 2050 yılına kadar beslemek için gıda üretimini ikiye katlama ihtiyacıyla, TALEN’ler ve diğer yeni ıslah yenilikleri, gıda güvenliğini sağlamak için temel araçlardır.
Bitkilerin ve alglerin dışında, TALEN’ler maya, meyve sineği, yuvarlak kurt, cırcır böceği, zebra balığı, kurbağa, sıçan, domuz, inek, ipekböceği ve insanlarda genleri değiştirmek için başarıyla kullanılmıştır.

Sonuç

TALEN’ler günümüzde en spesifik gen düzenleme aracı olmaya devam etmektedir.
TALEN’ler, herhangi bir diziyi hedefleyebilen ve bazı durumlarda CRISPR’den daha iyi performans gösterebilen son derece hassas gen düzenleme araçlarıdır.
Bununla birlikte teknoloji, tasarlanmış proteinlerin oluşturulmasını gerektirmektedir.
Teknoloji iyi kurulmuş, kanıtlanmış ve spesifik olmasının yanında, protein mühendisliği zaman alıcı ve pahalı sistemlerdir. Sadece bir kısmının yüksek performansı vardır. Ve eş zamanlı düzenlemeler yapmak zordur.
TALEN’ler moleküler genom mühendisleri için harikadır ver geçen gün TALEN’i kullanmanın daha yeni ve daha iyi yolları ortaya çıkacaktır.

Nedir bu CRISPR-Cas9?

CRISPR kümelerinin varlığı 1980’lerden beri bilinse de canlının savunma mekanizmasındaki rolü görece yeni kanıtlanmış durumda. 2013 yılından itibaren tüm bilim dünyasının ilgi odağı olan CRISPR-Cas9 sistemini kullanarak gen düzenleme teknolojisi Science dergisi tarafından bile bugüne kadar insanlığın keşfetmiş olduğu en hızlı, en başarılı, en ucuz ve yüksek doğruluk oranına sahip genom değiştirme yöntemlerinden birisi olarak tanımlanmıştır.
CRISPR (clustered regularly Interspaced short palindromic repeats = düzenli aralıklarla bölünmüş kısa palindromik tekrar kümeleri) /Cas9 (CRISPR ile ilişkili nükleaz-9), kısa tekrarlı baz dizileri içeren prokaryot DNA segmentleridir. Arkeaların tamamında ve bakterilerin yarısında bu sistem bulunmaktadır.
CRISPR-Cas9 nasıl işliyor?

Mutasyonu yaratan iki önemli molekül mevcut:

1. Cas9 adlı bir enzim: Genomun belirli yerlerinden iki DNA iplikçiğini kesebilen “moleküler bir makas” görevi görür. Böylece DNA parçaları eklenebilir veya çıkarılabilir.
2. Rehber RNA (gRNA): Daha uzun bir RNA iskeletin içindeki, önceden tasarlanmış küçük (yaklaşık 20 bazlık) bir RNA diziliminden oluşur. Uzun RNA iskeleti DNA’ya bağlanır ve önceden tasarlanmış dizilim Cas9’un genomun doğru noktasına gitmesine rehberlik eder. Böylece Cas9 enzimi doğru yerleri keser.
   • Hedef gRNA içinde bir Protospacer Bitişik Motifi (PAM) bulunmalıdır.
   • PAM sekansı aracılığı ile Cas9 enzimi ile ribonukleoprotein kompleksi oluşturan gRNA kompleksinin DNA’ya bağlanmasını sağlar.
   • Cas9 rehber RNA’yı izleyerek, DNA’da ilgili yere gider ve DNA’nın iki iplikçiğinde de kesik oluşturur.
   • Bu aşamada hücre DNA’nın hasar gördüğünü fark eder ve onarmaya çalışır.
   • Böylelikle DNA onarım mekanizması kullanılarak, ilgilenilen hücrenin bir ya da birden fazla geninde değişiklik yapabilir.

Gelecekte neler vadediyor?

• Kanser, HIV, Parkinson, Sıtma, Hepatit, görme kayıplarının düzeltilmesi gibi tedavisi çok zor olan ve mekanizması bilinemeyen birçok hastalığın tedavisinde yüksek potansiyele sahiptir. Bugüne kadar az da olsa hastalıkların tedavisinde bu sistemden faydalanılmıştır.
• Diğer gen düzenleme sistemlerinden çok daha kolay ve hızlı ve az maliyetli olduğu bilinmektedir.
• Üreme hücrelerinde yapılacak olan değişikliklerin nesilden nesile aktarılması ihtimali etik sorunları tetikleyeceğinden insanlar üzerinde kullanılması için uzun zaman var gibi görünmektedir.
• “Hedef dışı” etkilerin elimine edilmesine yönelik yapılan birçok çalışma mevcut. Sistem spesifik olsa da bazı durumlarda hedeflenen gen yerine başka bir noktanın kesilmesi şeklinde hata yapabilme ihtimali hala var.
• 2020 Nobel Kimya Ödülü de dahil olmak üzere birçok ödüle layık görülen sistemin başarışı hala %30’ları geçebilmiş değildir.

Sonuç

CRISPR/Cas teknolojisi, gün geçtikçe daha hassas ve verimli hale gelmektedir ve işlevsel genomik çalışmalar ile ürünlerin özelliklerinin geliştirilmesinde etkili bir araç olarak kullanılmaya devam edecektir.

Dijital PCR Nedir?

Dijital PCR, qPCR’ye alternatif bir metottur ve benzer karakteristiğe sahiptir. Dijital PCR (dPCR), nükleik asit ölçümü için oldukça hassas bir yaklaşımdır. Yaygın olarak nükleik asit belirlenmesinde kullanılan bir yöntemdir. Bu yöntem numunedeki hedef molekülün ilk miktarını belirlemek için qPCR’de olduğu gibi amplifikasyon döngülerinin sayısına güvenmek yerine; hedef moleküllerin mutlak sayısını istatistiksel yöntemlerle tahmin eder. Dijital PCR, hassas ve tekrarlanabilir nükleik asit tespiti ve miktar tayini için oldukça hassas bir yaklaşımdır. Ölçümler, herhangi bir bireysel reaksiyonda ‘’sıfır’’ veya ‘’bir’’ hedef molekül mevcut olacak şekilde numuneyi bölümlere ayırarak gerçekleştirilir. Her bölüm, bir floresan sinyalin varlığı veya yokluğu için son nokta PCR döngüsünden sonra analiz edilir ve numunede bulunan mutlak molekül sayısı hesaplanır. Numune hedef kantitasyonu için standart bir eğriye gerek duymaz. Standart eğrinin olmaması sayesinde hata payı azalır ve hassasiyet artar.

Nasıl Çalışır?

dPCR reaksiyonunda kullanılan test bileşenleri qPCR’da olduğu gibi master miks, primerler, TaqMan probları ve hedef DNA’dan ibarettir.
Her bir numuneyi çok sayıda ayrı ve paralel reaksiyona ayırarak veya bölerek analizi gerçekleştirir. Seyreltilmiş numuneye sahip master miks bölünerek tek tek PCR reaksiyonlarına dağıtılır. Bölümlerin içindeki moleküllerin dağılımı bağımsız ve rastgele bir işlemdir. Bazı bölümlerde bir veya daha fazla hedef molekül kalırken; diğerleri hiçbirini içermeyebilir. Tipik olarak 20.000 bölüm yapılır ve amplifiye edilir. Bölme işlemi kanallar içeren mikroplaka ya da damlacık yöntemi ile gerçekleştirilir. Her bölüm uç noktaya kadar PCR amplifikasyonuna tabii tutulur. Amplifiye olmuş numuneler ile olmayan bölümler ayrı ayrı sayılır. Endpoint tespit yöntemi ile her reaksiyon kuyucuğu ‘‘evet’’ ya da ‘’hayır’’ cevabını verir. Amplifiye edilmiş ürün içeren ve floresan sinyal gösterenler pozitif olarak belirlenir ve “1” olarak numaralandırılır. Amplifiye ürünü olmayan ve sadece arka plan sinyali gösteren olanlar negatif olarak belirtilir ve “0” olarak numaralandırılır. Ulaşılan sayı ikili sistem olduğu için dijital PCR olarak tanımlanmıştır. Poisson istatistiksel analizi ile daha sonra referanslara veya standartlara gerek duyulmadan ilk numunede bulunan hedefin mutlak DNA konsantrasyonunu doğrudan belirlenmesine olanak sağlar.

dPCR reaksiyonunda kullanılan test bileşenleri qPCR’da olduğu gibi master miks, primerler, TaqMan probları ve hedef DNA’dan ibarettir.
Her bir numuneyi çok sayıda ayrı ve paralel reaksiyona ayırarak veya bölerek analizi gerçekleştirir. Seyreltilmiş numuneye sahip master miks bölünerek tek tek PCR reaksiyonlarına dağıtılır. Bölümlerin içindeki moleküllerin dağılımı bağımsız ve rastgele bir işlemdir. Bazı bölümlerde bir veya daha fazla hedef molekül kalırken; diğerleri hiçbirini içermeyebilir. Tipik olarak 20.000 bölüm yapılır ve amplifiye edilir. Bölme işlemi kanallar içeren mikroplaka ya da damlacık yöntemi ile gerçekleştirilir. Her bölüm uç noktaya kadar PCR amplifikasyonuna tabii tutulur. Amplifiye olmuş numuneler ile olmayan bölümler ayrı ayrı sayılır. Endpoint tespit yöntemi ile her reaksiyon kuyucuğu ‘‘evet’’ ya da ‘’hayır’’ cevabını verir. Amplifiye edilmiş ürün içeren ve floresan sinyal gösterenler pozitif olarak belirlenir ve “1” olarak numaralandırılır. Amplifiye ürünü olmayan ve sadece arka plan sinyali gösteren olanlar negatif olarak belirtilir ve “0” olarak numaralandırılır. Ulaşılan sayı ikili sistem olduğu için dijital PCR olarak tanımlanmıştır. Poisson istatistiksel analizi ile daha sonra referanslara veya standartlara gerek duyulmadan ilk numunede bulunan hedefin mutlak DNA konsantrasyonunu doğrudan belirlenmesine olanak sağlar.

İş Akışı

• Reaksiyon Hazırlama
• Bölümleme Damlacık Nanofluidic Chip
• Amplifikasyon Aktarım
• Okuma
• Yazılıma Aktarım

Dijital PCR’nin Yıllara Göre İlerlemesi

• 1992 İlk dPCR sistemi tasarlandı ve tanımlandı.
• 1999 İlk dijital PCR terimini kullanan makale yayınlandı.
• 2007 İlk ticari dPCR sistemi, mikroakışkan çipler ve mikrodiziye dayalı olarak tanıtıldı.
• 2010 İlk ticari dPCR sistemi, dönen mikroakışkan disklere dayalı olarak tanıtıldı.
• 2011 İlk su-yağ emülsiyonu/damlacıklara dayalı ticari dPCR sistemi tanıtıldı.
• 2017 İlk ticari mikroplaka tabanlı dPCR sistemi tanıtıldı.
• 2020 İlk ticari nanoplate tabanlı dPCR sistemi piyasaya sürüldü.

qPCR’ye Göre Avantajları

Kantitatif PCR (qPCR), geniş bir dinamik aralık, yüksek verim ve çok sayıda numunenin taranmasıyla sonuçlanarak, zaman gerektiren yönlendirme uygulamalarında bağıl ölçüm için iyi yapılandırılmış ve tercih edilen bir yöntemdir.
dPCR’nin avantajları göz önüne alındığında kendisine birçok kullanım alanı bulmuştur ve bu potansiyel hızla devam etmektedir. Mutlak kantitasyon, karmaşık arka plandaki düşük hedef DNA’ları yüksek hassasiyetle tekrarlanabilir ölçümler yapmaya olanak sağlaması ile qPCR’ye göre önemli avantajlar sunar.
Çok az miktardaki hedef DNA’nın dakikalar içindeki miktarını tespit edebilme potansiyeli sayesinde diğer birçok yöntemi geride bırakan güçlü bir platformdur.
Ayrıca, bölümleme sayesinde inhibitörlere karşı artan tolerans ve amplifikasyon verimliliğine veya qPCR’de oluşturulan standart eğrilerin kalibrasyonundaki teknik sınırlamalar nedeniyle dPCR’nin geliştirilmesine olanak sağlamıştır. Tüm bu özellikleri dPCR’yi basit ve uygun maliyetli bir yeni nesil teknoloji haline getirir.

qPCR’nin Avantajları

• İyi kurgulanmış protokol ve veri analiz teknikleri
• Geniş dinamik alan
• Örnek başına düşük maliyet
• Yüksek numune verimi

dPCR’nin Avantajları

Standart eğri ya da referans örneğe ihtiyaç duyulmaması
• İnhibitörlere karşı yüksek tolerans
• Üstün ve artan hassasiyet
• Yüksek tekrarlanabilirlik
• Az örnek için bile basit iş akışı • Daha fazla PCR replikatı kullanarak hassasiyeti arttırma yeteneği
• Small-fold değişikliklerinin doğrusal tespiti

dPCR’nin Dezavantajları

• Henüz çok yaygınlaşmış olmaması
• Valide edilmiş metotların azlığı
• Ticari kitlerin üretilmemiş olması
Teknolojinin olgunlaşıp olgunlaşmayacağı, maliyetin de azalıp azalmayacağı şu an birçok araştırmacı için merak konusudur. Şu an az miktarda uygulama alanı olsa da yarın çok daha fazla kullanım sahasının olması beklenmektedir.
Metotlar birbirinin tamamlayıcıları durumundadır. Dolayısı ile dPCR, kullanım alanlarında hassasiyeti yakalamak isteyenlere daha doğrulayıcı bir yaklaşım sağlayabilecektir.

dPCR’nin Kullanım Alanları

Kopya sayısı varyasyonları;
• Nadir Mutasyon Tespiti
~Kanserin mevcut tespit seviyelerinin altında belirlenmesi
~Kanserde yeni mutasyonları ve kopyaları tespit etmek
~Nadir ilaç dirençli mutasyonların izlenmesi
• Viral yük tespiti
~Bakteriyel yük
• Gen ekspresyonu
~mRNA seviyelerinin belirlenmesi
• Metilasyon olaylarının incelenmesi
• NSG kütüphanelerinin kantitasyonu
• Absolüt kantifikasyon (Var/yok analizleri)
• Tek nokta mutasyonları (SNP)
• GDO analizleri
• Genotipleme
• Enfeksiyon hastalıkları (FactorV, MTHFR vb.)
• Çevresel testler
• Prenatal diyabetik
• Organ nakilleri
• DNA ekstraksiyonunun etkinliğinin belirlenmesi
• Düşük düzeyli patojenlerin kantitasyonu
• Yeterlilik testlerinde referans metot olma özelliği
• Laboratuvarlar arası sonuçların daha iyi karşılaştırılabilmesi

Neden dPCR’ye geçelim?

Nükleik asit hedefleri arasında standart eğriye gerek olmadan yüksek hassasiyetli kantitatif sonuç alabilme dPCR’nin en büyük gücü olarak gözükmektedir.
Patojen analizi ve GDO tespiti için uygun maliyetli yöntem sunması.
İnhibisyonlu örnek ve tohum örneklerinde yüksek hassasiyet sağlaması.
Basitleştirilmiş sonuç yorumlama sistemi.
Optimal altı sayılabilecek testlerde geliştirilmiş duyarlılık.