Plazmid Dizaynı ve Sentezi

Plazmid, kendi kendini eşleyebilen, kromozomdan ayrı bir DNA parçasıdır. Tipik olarak dairesel ve çift sarmallıdır. Genelde bakterilerde, bazen ökaryotlarda da (örneğin Saccharomyces cerevisiae deki 2 mikrometre plazmidi ) bulunur. Plazmidlerin boyu 1 ila 400 kilobaz çifti arasında değişir. Bir hücrede büyük bir plasmidin bir kopyası, daha küçük boy plazmidlerin ise yüzlerce kopyası bulunabilir. Hatta, yüksek kopya sayısına sahip olması amacıyla seleksiyona uğratılmış bazı yapay plazmidlerin (örneğin pUC plazmid serisindekilerin) binlerce kopyası olabilir.
 
Plazmid terimi Amerikalı moleküler biyolog Joshua Lederberg tarafından 1952'de ilk defa kullanılmıştır.
 
Antibiyotik direnci
 
Şekil 2: Antibiyotik dirençli bir plazmidin şematik gösterimi. 1 & 2 Direnç genleri. 3 Ori.
Çoğu plazmid içinde bulundukları bakteriye selektif avantaj sağlayan, bakteriyi bir antibiyotiğe dirençli yapmak gibi özellikler sağlayan genler veya gen grupları taşırlar.
 
Her plazmid kromozomdan bağımsız olarak kopyalanmasını sağlayan, bir DNA dizinine sahiptir. Replikasyon orijini (İngilizce origin of replication) veya 'ori' olarak adlandırılan bu dizin DNA replikasyonunun başlama noktasıdır (şekil 2). Çoğu plazmid, Şekil 2'de gösterildiği gibi daireseldir ama ökaryotların kromozomlarına yüzeysel olarak benzeyen, doğrusal (lineer) plazmidlerde vardır.
 
Epizomlar
Epizom, konak organizmanın kromozom DNA ile bütünleşebilen bir plazmiddir. Bu yüzden uzun süre bütünlüğünü koruyabilir, her hücre bölünmesinde kopyalanır ve genetik yapının bir parçası olarak varlığını sürdürür. Plazmidler için bu terim artık kullanılmamaktadır çünkü bir plazmidin epizom olmasına nedeni, hem o hem kromozomda bulunan, transpozon gibi bir homolog bölgenin varlığıdır. Memeli hücrelerinde epizom terimi, konak kromozomlardan birine kovalent olmayan şekilde başlanmış dairesel DNA (viral bir genom gibi) için kullanılır.
 
 
Şekil 3: Entegre olmayan plazmid (yukarda) ve epizomların (aşağıda) karşılaştırması. 1 Kromozom DNAsı. 2 Plasmidler. 3 Hücre bölünmesi. 4 Entegre plazmidli kromosomal DNA.
Vektörler
Genetik mühendisliğinde kullanılan plazmidlere vektör denir. Bir canlıdan diğerine gen aktarımı için kullanılırlar ve genelde seleksiyon için kullanılabilecek bir fenotip oluşturan bir genetik işaret taşırlar. Çoğu vektörde bir çoklubağlaç (İngilizce polylinker veya çoklu klonlama yeri (İngilizce multiple cloning site) de bulunur, buraya DNA parçalarının kolayca eklenmesi için yaygınca kullanılan restriksiyon yerleri içeren kısa bir bölgedir. Aşağıda Uygulamalar bölümüne bakınız.
 
 
Şekil 4: Bakteri konjügasyonunun ana hatları
Tipleri
Plazmidleri sınıflandırmanın bir yolu, başka bir bakteriye kendini aktarabilme yeteneğine göredir. Konjügatif plazmidler tra-genleri taşırlar, bunlar, bir plazmidin başka bir bakteriye trasnferi olan konjügasyon olayının gerçekleşmesini sağlarlar. Nonkonjügatif plazmidler konjügasyonu başlatamazlar, ancak konjügatif plazmidlerin yardımıyla, 'kazara' aktarılabililer. Bir ara sınıf olarak seferber edilebilir (İngilizce mobilizable) plazmidler sayılabilir, bunlar aktarım için gereken genlerin bir kısmına sahip oldukları için konjügatif plazmidlerin paraziti gibi davranırlar, ancak onların varlığında yüksek frekansta transfer olabilirler.
 
Farklı tiplerde plazmidlerin bir hücrede beraber bulunmaları mümkündür. E. coli 'de yedi farklı plazmid bir arada bulunmuştur. Ancak ilişkili plazmidler birbiriyle bağışıksızdır, yani temel plazmid işlevlerinin denetiminin bir sonucu olarak bunlardan sadece bir tipi varlığını sürdürebilir. Dolayısıyla plazmidler uyumluluk grupları 'na ayrılırlar.
 
Plazmidlerin bir diğer sınıflandırması işlevlerine göredir. Beş ana sınıf vardır:
 
Fertilite-F-plasmidleri, tra-genleri taşırlar. Bakteryel konjügasyon yapabilirler.
Rezistans-(R) plazmidleri, antibiyotik ve zehirlere karşı direnç sağlayan genler içerirler. Plazmidlerin ne olduğu bilinmeden evvelki zamanlarda R-faktörler olarak bilinirlerdi.
Col-plazmidleri, kolisinleri kodlayan genler içerirler. Kolisinler başka bakterileri öldürebilen protein türleridir.
Yıkıcı plazmidler, ender bileşiklerin (tolüen veya salisilik asit gibi) yıkımını sağlarlar.
Virülans plazmidleri bakterinin patojen olmasına neden olurlar.
Plazmidler bu grupların birden fazlasının birden üyesi olabilirler.
 
Her bakteride bir veya birkaç kopya halinde bulunan plazmidler, hücre bölünmesinin ardından yavru bakterilerden birine aktarılmama riskini taşırlar. Bu tür tek kopyalı plazmidler her yavru hücreye plazmidin bir kopyasının dağıtılmasını sağlayan sistemlere sahiptirler.
 
Bazı plazmidler bir bağımlılık sistemi veya ayrılma sonrası öldürme sistemi (İngilizce "postsegregational killing system (PSK)") içerirler. Hem uzun etkili bir zehir ve kısa etkili bir panzehir üretirler. Plazmidi tutan yavru hücreler sağ kalırlar, plazmidin bir kopyasını almamış bir yavru hücre ise ya ölür ya da ana hücreden kalan zehirin etkisiyle yavaş büyür. Bu plazmidlerin "bencil DNA" yönlerinin bir örneğidir.
 
Uygulamaları
Plazmidler biyokimya ve moleküler biyolojide kullanılan önemli araçlardır. Genlerin çoğaltılması (pek şok kopyasının elde edilmesi) veya ifadesi için kullanılan ticari kaynaklı pek çok plazmid mevcuttur.
 
Çoğaltılacak olan genin kopyası, hücreleri belli bir antibiyotiğe dayanıklı yapan genler içeren bir plazmide eklenir. Sonra plazmid, transformasyon olarak adlandırılan bir yöntemle bakterilerin içine sokulur. Ardından bakteriler o antibiyotiğe maruz bırakılırlar. Plazmid onları dirençli kıldığı için yalnızca plazmidi içine almış bakteriler antibiyotikli ortamda sağ kalırlar. Bu bakteriler çok sayıda büyütülürler, sonra toplanıp eritilerek (lizis) içlerindeki plazmid izole edilir.
 
Plazmidlerin bir diğer kullanımı çok miktarda protein üretimidir. Bu durumda arzu edilen geni taşıyan plazmidi içeren bakteriler büyütülür. Bakteriler antibiyotik direnci sağlayan proteinlerini üretmeye başlattıkları sırada eklenmiş genden bol miktarda protein üretmesini sağlayacak şekilde uyarılabilir. Bu şekilde bir gen veya onun kodladığı bir protein (örneğin insülin), hatta antibiyotikler ucuz ve kolay bir şekilde üretilebilir.
 
Plazmid DNA eldesi
Plazmidler çoğu zaman belli DNA dizinlerinin saflaştırılması için kullanılırlar, çünkü genomun geri kalanından kolayca ayrıştırılabilir. Vektör olarak kullanımları ve moleküler klonlama için plazmidlerin izole edilmesi gerekir.
 
Bakterilerden plazmid DNA'sı elde etmenin birkaç yöntemi vardır. Bunlar miniprep, midiprep ve maksiprep olarak adlandırılırlar. Birincisi genelde plazmidin arzu edilen özelliğe sahip olduğunu kontrol etmek için kullanılır. Elde edilen DNA çok saf olmamakla beraber restriksiyon sindirimi ve bazı basit klonlama tekniklerine yetecek kalitededir.
 
Maksiprep tekniğinde büyük hacimli hücre süspansiyonu kullanılır. Yapılan işlem esas olarak büyük ölçekli bir miniprep tekniğidir, üzerine ek saflaştırma adımları gelir.Sonuçta nispeten bol miktarda (birkaç mg) çok saf plazmid DNA'dır.
 
Yakın yıllarda farklı ölçeklerde , saflık derecelerinde ve otomasyon seviyelerinde plazmid saflaştırması yapmayı sağlayan çeşitli ticari kitler oluşturulmuştur.

 

İletişim

Adresimiz

Kazım Dirik Mah. 296/2 Sok. No:33 Originn 35100
Bornova Izmir
TÜRKİYE

  • Email: info@letgenbio.com
  • Telefon: +90 850 441 2987
  • Fax: +90 232 971 0855

Bize Yazın

Adınız:
Email Adresiniz:
Mesajınız: