RNA araştırma

İşte Norgen’in SiC tabanlı RNA izolasyon teknolojisini klasik Silika teknolojisine tercih etmemiz için 5 neden

Bilginin kümülatif aktarımının sonucu olarak her yıl biyoteknoloji alanında sıçramalar ve buluşlar ortaya çıkmaktadır. Özellikle son zamanlarda içerisinde bulunduğumuz pandeminin de etkisiyle bu alana ilgi artmış, faaliyetler ve yatırımlara büyük bir önem verilmeye başlanmıştır. Günlük hayatımızın artık bir parçası olan Covid-19 ve bununla mücadele/ araştırma yöntemlerinde karşımıza sürekli çıkan “örnek toplama” ise hala aşılması gereken bir sorun olarak yerini korumaktadır. Bu konuya bu kadar önem verilmesinin nedeni ise, insandan alınan örnekler ile direkt çalışılması ve bu örneklerde virüs RNA’sının aktif olarak bulunmasından kaynaklı bulaş ihtimalinin çok yüksek olmasıdır. Bu yüzden şu anda aktif olarak birçok marka farklı örnek toplama şekilleri ve saklama koşulları aramaktadır. Örnek toplama ve saklamadan sonra gelen RNA izolasyonu ise biyoteknoloji alanında başlı başına ayrı bir çalışma konusu olmakla beraber bu alanda araştırmalar hız kesmeden devam etmektedir. Yapılan çalışmalarda sadece RNA eldesinin yetersiz gelmesiyle beraber bilim insanları bütün boyut ve tiplerden RNA elde etme yöntemleri geliştirmeye başlamışlardır. İlk olarak 1987 yılında Trizol veya TRI Reagent olarak bilinen acid phenol/ guanidine thiocyanate reaktiflerine dayanan bir RNA izolasyon yöntemi geliştirilmesiyle başlayan bu süreç çeşitli varyasyonlara uğrayarak ilerlemeye devam etmektedir. Geliştirilen bu ilk yöntemle yüksek verimlilikte sonuçlar elde edilmesine karşın bu süreç uzun sürmekte ve bazı zararlı organik çözeltiler kullanılmasına dayanmaktaydı. İlerleyen dönemlerde ise silika tabanlı spin column yöntemine dayanan total RNA izolasyon kitleri insanların dikkatini çekmeye başladı. Bu yönteme dayalı kitlerde phenol gibi zararlı bileşenlere gerek olmamasına karşın bu kitlerle elde edilen izole RNA genellikle 200 nükleotidden uzun olmakta ve small RNA’ler süreç dışı bırakılmaktaydı. Bu yöntemde; bağlanma, yıkama ve ayrıştırma basamakları temel alınarak, ortamdaki tuzlar sayesinde nükleik asitlerin silikadan oluşturulmuş membrana bağlanması sağlanır. Daha önce de belirtildiği gibi bu yönteme dayalı kitlerle genellikle small RNA’ların kolona bağlanması gerçekleşmez fakat acid phenol yardımı ile bu işlem gerçekleştirilebilir. Her ne kadar istenilen sonuçlar elde ediliyor olsa da tüm bu yöntemler zaman alıcı ve zararlı kimyasal içerikli olmayı sürdürmektedir. Bu nedenle tüm RNA tiplerini kapsayacak zararsız ve hızlı bir izolasyon yöntemine ihtiyaç duyulmaktaydı ve bu alandaki son yeniliklerden birine imza atan Norgen; Silicon Carbide tabanlı yöntemi ile karşımıza çıkıyor.

İşte Norgen’in Rakiplerinden Ayrılmasını Sağlayan Silicon Carbide Teknolojisinin 5 Özelliği;

      1. Geniş çaplı RNA bağlanma spektrumu

Klasik silika tabanlı teknolojide GC oranı ve moleküler ağırlığa göre RNA bağlanması değişkenlik gösterirken, Norgen’in silicon-carbide teknolojisinde GC yüzdelik, ağırlık veya başka bir parametreye bağlı kalmadan tüm RNA türleri için eşit bir bağlanma sağladığı görülmüştür. Bu eşit bağlanma oranına 200 nükleotidden küçük veya büyük small RNA türleri bile dahil edilmiştir. Geliştirilen bu teknoloji ile artık içeriğe veya ağırlığa bağlı false-negative sonuçlardan kaçınılmış olmaktadır.

       2. Yüksek Hassaslık

Viral deteksiyonda kullanılan çoğu RT-qPCR viral diyagnostik kitlerinin hassaslığı ne yazık ki kullanılan RNA kalitesine bağlı olarak değişmekte. Norgen’in SiC teknolojisi en yüksek verimlilikte viral RNA eldesine izin verirken aynı zamanda 400 copies/mL tükürük örneği ile deteksiyon çalışmalarına da olanak sağlar. (10 viral copies/PCR reaction). Bu özelliği asemptomik veya iyileşmekte olan hastalardan alınan az miktardaki örneklerle çalışma için ideal bir ortam sağlamaktadır.

SiC teknolojisinin RNA boyut ve cinsine bağlı kalmaksızın çalışabilmesi, Viral Taşıma Ortamında (VTM) saklanan nükleik asitlerin ileri zamanlardaki kullanımı açısından da avantaj sağlamaktadır. Çünkü zamanla bu medyada saklanan örnekler degrede olabilir. Zamanla solüsyon içerisinde degrede olup küçük fragmentlere ayrılmış nükleik asitleri bile başarıyla yakalayabilen bu teknoloji sayesinde parçalanmış viral RNA’lara ulaşılabilir. Silika bazlı çalışmalarda ise bu durum tam tersine işlemektedir yani; silika membran yeteri kadar hassas olmadığı için bu küçük degrede olmuş RNA’ları yakalayamaz ve false-negatif sonuçlar elde edilmesine sebep olur. SiC teknolojisinin kullanımı, zamana bağlı viral RNA degradasyonundan bağımsız olarak SARS-CoV-2'nin doğru tespitini sağlar.

       3. Taşıyıcı RNA-free ekstraksiyonu

Günümüzde aşırı düşük RNA içeriğinin bağlanma verimliliğini arttırmak için Poly(A) Taşıyıcı RNA kullanımı aşırı yaygınlaşmış durumdadır. Bu her ne kadar istenilen sonucu verse de taşıyıcı RNA’nın varlığı ileride gerçekleştirilecek bazı downstream uygulamalarının (RNAseq) hassaslığını olumsuz yönde etkileyebilir. Norgen’in bu alanda son olarak geliştirdiği yüksek hassasiyete sahip SiC teknolojisi sayesinde taşıyıcı RNA’ya gerek kalmadan aşırı düşük RNA girdileri ile çalışarak hedef sekansların verimliliği artmaktadır.

      4. Phenol/ chloroform-free ekstraksiyon

Yazının başında da bahsedildiği üzere, RNA izolasyonunda ağır kimyasal kullanımı her ne kadar istenilmese ve zararlı olsa da sıklıkla başvurulan bir yöntem olmaya devam etmektedir. Phenol/ chloroform hala yaygın olarak kullanılıyor olmasına karşın gerçekleştirilen işlemler çok yorucu olup yüksek hacimli sonuçlara ulaştıramamaktadır. Bunlara ek olarak, bu ağır kimyasalların kullanılması elde edilen sonucun saflığını da bozabilmektedir.

Rakiplerinden bu alanda da ayrılmayı başaran Norgen, kitlerinde hiçbir şekilde phenol/chloroform veya başka zararlı kimyasal kullanmamaktadır ve bu sayede elde edilen sonuç devamında uygulanacak hassas moleküler işlemler için saflığını korumuş olur.

        5. Virüs inaktivasyonu

Hastalık araştırmalarında toplanılan örneklerde evrensel transport medyası (UTM) ve VTM kullanılması sıklıkla karşılaşılan bir durumdur. Fakat bu şekilde taşınan örneklerin ne yazık ki bunlarla çalışan görevlilere bulaşarak hasta etme gibi bir olasılıkları vardır.

Norgen kitinin içerisinde bulunan Lysis Buffer A ve Buffer RL, UTM ve VTM medyaları ile uyum içinde çalışarak örnekleri bulaşıcı olmayan hale getirir ve bu medyaları kullanan örnekleme yöntemleri için idealdir.

W.S. Kim et al. tarafından 2015 yılında yayınlanan bir çalışmada⁽¹⁾ phenol/chloroform yöntemi, silica column ve SiC column yöntemleri karşılaştırılmıştır. Miktar olarak en fazla RNA eldesi phenol/chloroform yöntemi ile elde edilmiş olup bu sırayı silica column ve Sic column takip etmiştir⁽¹⁾. Fakat nitelik olarak bakıldığında yani elde edilen RNA saflığına bakıldığında phenol/chloroform yönteminin diğer iki column methodundan gözle görülür bir farkla düşük olduğu ve en yüksek verimin SiC teknolojisiyle elde edildiği gözlemlenmiştir⁽¹⁾. Bu verilerin önemi ileriki aşamalarda yapılacak downstream aşamalarında karşımıza çıkmaktadır. Phenol/chloroform methodunda elde edilen RNA verimi düşük olduğu olduğu için devamında gerçekleştirilecek PCR veya microarray gibi işlemler için clean-up prosedürü uygulanmak zorunda kalınmaktadır. Bu açıdan bakıldığında SiC teknolojisi ve Silica column yöntemi aynı verimliliği ve kolaylığı sağlarken, elde edilen small RNA bakımından birbirlerinden ayrılmaktadırlar⁽¹⁾. Elde edilen verilere göre, SiC teknolojisi silika spin columndan daha fazla small RNA pürifiye etmiştir⁽¹⁾. Agilent 2100 Bioanalyzer kullanılarak small RNA assay gerçekleştirildiğinde small RNA ve miRNA’lerin SiC teknolojisiyle pürifiye edilmiş örneklerde daha çok bulunduğu gözlemlenmiştir⁽¹⁾.

       1. Kim, W., Haj-Ahmad, Y., Stobbs, L. and Greig, N., 2015. Evaluation of viroid extraction methods and application of a one-step reverse transcription real-time polymerase chain reaction assay (RT- qPCR) for the rapid detection ofChrysanthemum stunt viroid(CSVd) infection. Canadian Journal of Plant Pathology, 37(2), pp.221-229.